HBsAg的單克隆抗體制備、表位分型及其應(yīng)用研究.pdf

1、臨床上,通過檢測HBV血清標志物來輔助判斷HBV感染與否,評價預(yù)后、治療方案和藥物反應(yīng)等。HBsAg是感染HBV后最早出現(xiàn)在血液中的標志物之一,通常在肝臟組織產(chǎn)生生化指標異常或表現(xiàn)出黃疸癥狀前2-8周即可在血液中檢測到HBsAg。因此,在血液篩查和臨床診斷中,HBsAg是檢測HBV感染情況的首選指標。HBsAg由HBV的S基因編碼,根據(jù)HBsAg表面抗原決定簇的不同,可以將其分為不同亞型,主要包括:adw、adr、ayw和ayr。共同決

2、定簇“a”存在于所有HBsAg,而d/y,w/r是兩對互斥決定簇。不同亞型具有明顯的地理分布特點,并且與疾病的發(fā)生發(fā)展呈一定相關(guān)性,HBsAg血清型的臨床意義也是當(dāng)前HBV研究的熱點之一。在今后的HBV檢測項目中,如果能夠同時對HBsAg亞型進行鑒定,將為疾病的治療方案和預(yù)后判斷提供非常有價值的參考。共同決定簇“a”存在于所有HBsAg中,因此成為免疫檢測和疫苗設(shè)計的最佳靶點。
　　 HBsAg的檢測方法有很多,主要是基于抗原-

3、抗體反應(yīng)的夾心ELISA方法。該方法具有成本低,操作簡單、適用于大規(guī)模篩選等優(yōu)點,是目前最為常用的檢測方法。近年來,相繼有新的檢測方法與技術(shù)問世,包括微粒子酶免疫分析,化學(xué)發(fā)光免疫分析等方法?？傮w而言,特異性好且敏感性高的HBsAg單克隆抗體始終是各種方法與技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)與前提。
　　 本研究著眼于我國HBsAg檢測水平與目前存在的問題,探討了高敏感性高特異性HBsAg單克隆抗體的制備與應(yīng)用,同時對HBsAg亞型單抗的制備進行了

4、初步探索,主要包括以下三個方面的內(nèi)容:
　　 1.HBsAg共同決定簇“a”單克隆抗體的制備。分別用抗原HBsAg-ay和HBsAg-ad免疫兩組Balb/C小鼠,3次免疫之后檢測小鼠血清中HBsAg-ay或HBsAg-ad特異性抗體效價。選擇血清抗體效價較高的小鼠作為脾細胞來源,利用PEG作為融合劑將脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合。經(jīng)篩選獲得陽性雜交瘤細胞,利用有限稀釋法進一步分選出分泌單一表位抗體的雜交瘤細胞,最終獲得5株

5、穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株。對HBsAg-ay和HBsAg-ad抗原免疫獲得的抗體進行交叉驗證,篩選出共同決定簇“a”特異性抗體3株,分別為命名為＃3-11-2,＃3-16-1和＃6-2-2。
　　 2.共同決定簇“a”特異性抗體的功能分析與應(yīng)用研究。對2株親和力較好的抗體進行亞型鑒定發(fā)現(xiàn),＃3-11-2為IgG2a,κ輕鏈:＃6-2.2為IgG1,κ輕鏈。利用競爭ELISA方法對各抗體進行表位鑒定。以特異性強、親和力好為原則從

6、中選擇出一組不同表位抗體,通過優(yōu)化參數(shù),確立了一個最佳的HBsAg檢測體系:0.8μg/mL,＃6-2-2包被,1:10,000稀釋＃3-11-2-HRP的檢測效果最為理想。以市場上廣泛認可的試劑盒陽性對照品作為樣本,檢測本體系的有效性和靈敏性。進一步利用優(yōu)選的一對＃6-2-2和＃3-11-2-HRP建立夾心ELISA檢測HBsAg方法,對正常人和乙肝患者血清標本進行檢測,并且與臨床醫(yī)院應(yīng)用的檢測方法進行比較,本研究中建立的體系表現(xiàn)出較

7、好的實際應(yīng)用能力。
　　 3.初步探索HBsAg血清型單克隆抗體的制備。在前期共同決定簇“a”特異性單抗制備工作的基礎(chǔ)上,探索HBsAg亞型單抗的制備。在第一部分中,HBsAg-ay和HBsAg-ad抗原免疫篩選到共同決定簇“a”特異性抗體的同時,還有一部分抗體能且僅能與免疫抗原相互作用,在HBsAg-ay和HBsAg-ad之間無顯著交叉反應(yīng)。說明這些抗體是特異性識別“y”或“d”表位的。以此為原理,篩選到2株HBsAg“y”特