運(yùn)用表位嵌合型3型腺病毒載體制備EV71單克隆抗體.pdf

1、目的:
　　運(yùn)用腺病毒“衣殼嵌合”策略，將腸道病毒71型（EV71）的雙中和線性抗原表位嵌入到人3型腺病毒（Ad3）六鄰體高變區(qū),構(gòu)建重組3型腺病毒，免疫小鼠，嘗試制備對(duì)腸道病毒EV71感染所致疾病具有保護(hù)、治療或診斷意義的單克隆抗體(mAb)；進(jìn)一步探索依賴“衣竅嵌合”策略，運(yùn)用病原體抗原表位制備相應(yīng)mAb的可行性。
　　方法:
　　將六鄰體高變區(qū)中同時(shí)嵌入EV71的SP55和SP70兩個(gè)抗原表位基因的重組人3型腺病

2、毒作為免疫原免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)與間接ELISA實(shí)驗(yàn)制備并篩選針對(duì)EV71的單克隆抗體。運(yùn)用病毒體外微量中和實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定單克隆抗體的中和活性；運(yùn)用間接ELISA實(shí)驗(yàn)、Western blot、直接免疫熒光試驗(yàn)鑒定單克隆抗體識(shí)別的表位。
　　結(jié)果:
　　本研究獲得了識(shí)別結(jié)合EV71特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞：D2C9、2C4、I2G2、I12C3。其中D2C9株腹水間接ELISA實(shí)驗(yàn)效價(jià)1：8000000，其

3、余3株腹水效價(jià)為1：250000；Westernblot實(shí)驗(yàn)表明4株單抗均特異性識(shí)別EV71病毒與EV71 VP1蛋白，D2C9識(shí)別結(jié)合SP70表位肽，而2C4、I12C3、I2G2識(shí)別結(jié)合SP55表位肽；4株單抗進(jìn)行直接免疫熒光法( DFA)鑒定，均對(duì)EV71陽(yáng)性，而與CoxA16無(wú)交叉反應(yīng)；病毒體外微量中和試驗(yàn)表明4株單抗隆抗體均未具備中和EV71的能力，并且D2C9能誘導(dǎo)出現(xiàn)病毒抗體依賴性增強(qiáng)作用現(xiàn)象。
　　結(jié)論:
　

4、　本研究共獲得了針對(duì)EV71 SP55肽或SP70肽的4株單抗，該4株單抗與EV71病毒親和力高，且與CoxA16無(wú)交叉反應(yīng)；本研究證明了非同屬病原體的外源表位肽通過(guò)“衣殼嵌合”策略嵌入到腺病毒六鄰體蛋白上，并以此作為免疫原，制備外源表位肽特異性及非同屬病原體特異性單克隆抗體具有一定可行性，而由于EV71 SP55與SP70肽內(nèi)中和表位均為線性表位，還需要嵌入更多的外源表位肽包括構(gòu)象表位肽來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證；同時(shí)4株抗體均為非中和性單抗，證明