建蘭花葉病毒單克隆抗體制備及其檢測應(yīng)用.pdf

1、建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaic virus，CymMV)和齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossumringspot virus，ORSV)是蘭花上分布最廣、危害最嚴(yán)重的兩種病毒，嚴(yán)重影響了其經(jīng)濟(jì)價值和觀賞價值。本實驗主要從生物學(xué)、血清學(xué)、電鏡技術(shù)方面對兩種病毒進(jìn)行了鑒定，并制備了建蘭花葉病毒的單克隆抗體，建立了抗原包被的ACP-ELISA檢測方法。研究工作取得的主要結(jié)果如下： 1．CymMV和ORSV的鑒定經(jīng)2％

2、磷鎢酸負(fù)染和CymMV、ORSV抗血清間接ELISA方法篩選到的分別含有線狀病毒和桿狀病毒粒子的蝴蝶蘭病葉汁液摩擦接種藜科、茄科和葫蘆科3科9種指示植物，發(fā)現(xiàn)：所有被病毒侵染的植物均不顯示系統(tǒng)癥狀。接種CymMV陽性蘭花病葉汁液的曼陀羅、昆諾藜只有局部壞死斑和褪綠斑，莧色藜上無癥狀。接種ORSV陽性蘭花病葉汁液的莧色藜、昆諾藜呈現(xiàn)與曼陀羅相同的癥狀。兩種病毒均不侵染普通煙、三生煙、珊西煙、心葉煙、本氏煙和黃瓜。SDS-PAGE電泳蛋白分

3、析表明，CymMV和ORSV提純病毒樣品各自只出現(xiàn)一條蛋白帶，分子量分別約為27kD和17 kD。間接ELISA檢測結(jié)果顯示兩種提純病毒與TuMV、PVX、PVY、TMV單抗均無反應(yīng)。電鏡下觀察超薄切片，可看到：感染CymMV的葉片細(xì)胞內(nèi)有帶狀病毒內(nèi)含體，感染ORSV葉片細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有層間傾斜排列的結(jié)晶體。此外，還進(jìn)行了免疫膠體金標(biāo)記。感染CymMV葉片細(xì)胞質(zhì)內(nèi)帶狀病毒內(nèi)含體上膠體金顆粒分布密集，感染ORSV的葉片細(xì)胞質(zhì)內(nèi)病毒內(nèi)含體上也集中

4、了較多的膠體金顆粒，健康葉片的細(xì)胞內(nèi)幾乎沒有金顆粒。以上結(jié)果表明我們從蘭花上分離到的兩種病毒分別為CymMV和ORSV。 2．CymMV單克隆抗體的制備及其檢測方法的建立用建蘭花葉病毒(CymMV)免疫的BALB/c鼠脾細(xì)胞與Sp2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選克隆，獲得2C6、587和12G9共3株能穩(wěn)定傳代并分泌抗CymMV單克隆抗體(MAbs)的雜交瘤細(xì)胞，3株單抗都僅對CymMV有特異性反應(yīng)，而與BBWW-1、BBWV-2

5、、CarMV、PVY、TMV、ToMV、TuMV、LSV、ToYMV和CMV等病毒均無交叉反應(yīng)。Western-blot印記分析表明，3株單抗只與CymMV的27kD外殼蛋白有特異反應(yīng)。其中587和12G9 2株單克隆抗體腹水間接ELISA效價達(dá)10<'-6>?？贵w類型及亞類鑒定顯示，3株抗體的抗體類型及亞類均為IgG1，輕鏈均為κ鏈。利用單克隆抗體建立了抗原包被間接EIASA(ACP-ELISA)檢測CymMV的方法，靈敏度高。病葉作