鋰調(diào)控缺氧NSCs增殖的作用機制研究.pdf

1、目的：
　　通過分離培養(yǎng)及鑒定新生SD乳鼠NSCs，建立缺氧NSCs模型，以氯化鋰作為干預措施，探討鋰是否通過 PI3K/Akt信號通路調(diào)控缺氧 NSCs增殖，為臨床應用鋰治療HIBD提供更有力的實驗和理論證據(jù)。
　　方法：
　　1. NSCs分離、培養(yǎng)及鑒定：脫頸處死新生1天內(nèi)SD乳鼠，75％酒精浸泡消毒，分離海馬組織，剔除腦膜及血管，平衡鹽溶液沖洗，剪碎海馬組織，0.25%胰酶消化后離心，重懸細胞后按5×105/m

2、l的密度接種于含無血清培養(yǎng)基的25ml培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，2-3天半量換液一次，5-7天傳代，得到NSCs。將部分傳代 NSCs按5×105/ml的密度接種于含新生小牛血清培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。采用免疫組織化學技術鑒定NSCs及其增殖分化功能。
　　2.建立缺氧NSCs模型：將傳代培養(yǎng)的NSCs按5×105活細胞/ml的密度移入無糖 DMEM培養(yǎng)基中，放入通入5%CO2和95%N2混合氣體的

3、缺氧盒，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。以通氣體時間30分鐘、1小時及2小時為檢測時相點，取出細胞在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、臺盼藍細胞計數(shù)和 CCK-8法檢測 NSCs活性，然后更換無血清培養(yǎng)基。以上三點與正常對照組存在差異，則表明缺氧 NSCs模型制作成功。
　　3.氯化鋰干預調(diào)控缺氧NSCs增殖機制：根據(jù)實驗要求，將傳代培養(yǎng)的NSCs分為正常對照組，單純?nèi)毖踅M，生理鹽水干預組，1mM、3mM、5mM氯化鋰干預組等6組；按5×105

4、活細胞/ml密度接種至6個35mm培養(yǎng)皿中，其中，正常對照組加入無血清培養(yǎng)基；其余組加入無糖 DMEM培養(yǎng)基后入自制缺氧盒，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。缺氧1小時，取出缺氧后的 NSCs顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、記數(shù)，并迅速更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，單純?nèi)毖踅M僅缺氧，生理鹽水干預組缺氧后加生理鹽水，3組氯化鋰干預組分別加入氯化鋰至所需的濃度，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后檢測 Akt/P- Akt、GSK-3?/P-GSK-3

5、?、Caspase-9/P-Caspase-9。
　　結果：
　　1. NSCs分離、培養(yǎng)及鑒定：新生SD乳鼠海馬分離的細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，呈懸浮生長，細胞呈單個、成對或三個不等、折光性強、邊界清楚、呈亮圓形。培養(yǎng)3天后細胞增殖成發(fā)亮的圓球狀細胞團，大小不等。培養(yǎng)5-7天時神經(jīng)球逐漸增大，數(shù)量逐漸增多，形態(tài)規(guī)則，中央部發(fā)黃，折光性明顯降低，周圍無突起生長。傳代培養(yǎng)細胞形態(tài)同原代，經(jīng) Nestin鑒定該細胞為 N

6、SCs，BrdU證實 NSCs處于增殖狀態(tài)；誘導 NSCs分化后細胞邊緣產(chǎn)生大量突起，互相交織成網(wǎng)，呈三角形、梭形等多種形狀，經(jīng)NSE及GFAP鑒定分化的細胞為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞。
　　2. NSCs缺氧模型制作：在無糖 DMEM培養(yǎng)基和缺氧盒中缺氧培養(yǎng)1小時后， NSCs形態(tài)不規(guī)則、數(shù)量減少、折光性減弱、胞體腫脹、甚至出現(xiàn)細胞膜破裂；缺氧組NSCs死亡數(shù)明顯增多、活性明顯降低（P均<0.05），證明缺氧NSCs模型成功。

7、>　　3.氯化鋰調(diào)控缺氧 NSCs增殖的機制：3mM氯化鋰干預組與單純?nèi)毖踅M、生理鹽水干預組、1mM氯化鋰干預組相比紅色熒光最強，表明3mM氯化鋰干預組缺氧NSCs主要表達P-Akt、P-GSK-3β、P-Caspase-9標記物；5mM氯化鋰干預組紅色熒光較3mM氯化鋰干預組減弱，綠色熒光增強，表明該組細胞主要表達Akt、GSK-3β、Caspase-9標記物。1mM、3mM氯化鋰干預組P-Akt/P-GSK-3?/P-Caspase

8、-9陽性細胞數(shù)較單純?nèi)毖踅M、生理鹽水干預組明顯增多（P<0.05）；與3mM氯化鋰干預組相比，5mM氯化鋰干預組陽性細胞數(shù)明顯減少（P<0.05）。
　　結論：
　　1.自制缺氧盒可以成功建立NSCs缺氧模型。
　　2.1mM、3mM氯化鋰均能促進缺氧 NSCs增殖，但3mM氯化鋰促進缺氧 NSCs增殖的能力較1mM氯化鋰強；5mM氯化鋰抑制缺氧NSCs增殖。
　　3.1mM、3mM氯化鋰干預促進缺氧NSCs增殖

9、時，Akt、Caspase-9及GSK-3?表達逐漸減弱，P-Akt、P-Caspase-9及P-GSK-3?表達逐漸增強。
　　4.5mM氯化鋰干預抑制缺氧NSCs增殖時，Akt、Caspase-9及GSK-3?表達逐漸增強，P-Akt、P-Caspase-9及P-GSK-3?表達逐漸減弱。
　　5.氯化鋰增加GSK-3?、Caspase-9酶活性與其劑量存在相關性。
　　6.氯化鋰通過PI3K/Akt信號通路調(diào)控缺