A2BAR在調控缺氧誘導腸粘膜屏障損傷中的作用及機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　腸粘膜屏障是機體的重要屏障結構,包括機械屏障、免疫屏障、生物屏障和化學屏障。其中機械屏障是最重要,也是最基礎的屏障結構。各種急、慢性病理情況,如外科手術應激、戰(zhàn)創(chuàng)傷、燒傷、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)、缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)和全胃腸外營養(yǎng)(total parenteral nutrition,TPN)等均可導致腸粘膜屏障損傷,引

2、發(fā)內(nèi)毒素、細菌入血,進而引發(fā)全身炎癥反應綜合征(SystemicInflammatory Response Syndrome,SIRS),最終導致導致多臟器功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS)。盡管目前針對不同病理條件下腸粘膜屏障功能的調控機制做了大量研究工作,但在急、慢性病理條件下腸粘膜損傷及損傷后修復機制尚未闡明。
　　腺苷(Adenosine,Ado)是腺嘌呤核苷酸的前

3、體和代謝產(chǎn)物,作為一種神經(jīng)遞質和調質,廣泛分布于全身各系統(tǒng)及組織,調節(jié)著多種重要的生理及病理過程。在炎癥反應、凝血過程、I/R或缺氧的條件下,細胞外腺苷濃度高度聚集,通過激活并結合細胞膜上的與G蛋白偶聯(lián)的腺苷受體(Adenosine Receptor,AR),從而啟動一系列的信號轉到過程。目前已發(fā)現(xiàn)AR有4種亞型,并已被成功克隆AR分為A1,A2A,A2B,A3腺苷受體。A1受體與Gi/G0蛋白偶聯(lián),A3受體與Gi蛋白偶聯(lián),抑制腺苷酸環(huán)

4、化酶(adenylate cyclase,AC)的活性,減少環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的水平;A2A、A2B與Gs蛋白偶聯(lián),激活AC的活性,增加cAMP的水平。低濃度的腺苷即可激活A2A受體,而只有較高濃度的腺苷才能激活A2B受體,提示在生理狀態(tài)下基礎水平的腺苷主要激活A2A受體,當腺苷水平上升超過生理水平或達到病理水平時A2B受體才被激活[2,3]。
　　A2B受體(Adenosine A2B receptor,A2BAR)參與調節(jié)

5、機體多種生理及病理過程,包括活化肥大細胞、抑制血管平滑肌細胞的生長、刺激內(nèi)皮細胞生長、舒張血管、調節(jié)炎癥因子的釋放、調節(jié)腸道氯離子分泌等[4,5,6,7,8]。研究發(fā)現(xiàn),急性缺血和缺氧條件可以誘發(fā)腸道A2BAR高表達[9],進而參與調節(jié)缺血和缺氧對腸粘膜的損傷后修復的過程。而在IBD模型中,A2BAR/KO小鼠腸道損傷較WT小鼠輕,且A2BAR通過加強巨噬細胞分泌IL-6而起到促進腸道炎癥作用[10]。對于A2BAR的在急、慢性病理條件

6、中如何參與調控腸粘膜屏障功能的研究,目前仍不明確。因此,本課題擬建立I/R小鼠模型及體外腸粘膜屏障模型,應用蛋白印跡、激光共聚焦、U氏灌流系統(tǒng)、跨上皮電阻測定、RT-PCR等技術,探討I/R條件下A2BAR的激活及失活對維持腸粘膜屏障功能關鍵的分子Claudin-1、Occludin、ZO-1等的表達及結構的變化。并通過U氏灌流系統(tǒng)及跨上皮電阻技術測定跨上皮電阻(TER),明確I/R條件及缺氧條件下A2BAR的激活與失活對腸粘膜屏障的調

7、控機制,為腸粘膜屏障損傷及修復機制提供新的思路。
　　方法：
　　1.建立小鼠腸道I/R損傷模型,通過免疫組織化學、蛋白印跡、RT-PCR及U氏灌流系統(tǒng)技術,測定小鼠腸粘膜中A2BAR的表達;利用阻斷劑PSB1115抑制A2BAR表達后,觀察Claudin-1、Occludin、ZO-1mRNA、蛋白表達水平及腸粘膜跨上皮電阻,了解I/R條件下A2BAR的失活如何影響腸粘膜緊密連接蛋白的表達及腸屏障功能。
　　2.建立

8、腸上皮細胞系Caco-2缺氧及A2BAR抑制劑PSB1115干預模型,通過transwell小室培養(yǎng)腸上皮細胞、跨上皮電阻(TER測定技術,了解缺氧及PSB1115(A2BAR特異性抑制劑)干預情況下TER的變化情況。通過蛋白印跡、RT-PCR、激光共聚焦技術,檢測常氧、缺氧及缺氧條件下PSB1115干預對腸上皮Claudin-1、Occludin、ZO-1表達及結構的影響。
　　3.建立腸上皮細胞系Caco-2模型,采用人結腸癌

9、Caco-2細胞建立腸上皮細胞缺氧模型,分為常氧組、常氧加Forskolin(腺苷酸環(huán)化酶激動劑作用)組、缺氧8h組、缺氧8h加SQ22536(腺苷酸環(huán)化酶抑制劑)組;采用cAMP檢測試劑盒,檢測實驗各組缺氧前后cAMP水平的變化;RT-PCR及Western-blot方法分別檢測各組腸上皮緊密連接蛋白claudin-1及occludinm RNA和蛋白表達水平的變化;檢測各組腸上皮TER的變化情況。探討缺氧條件下環(huán)磷酸腺苷(cAMP)

10、水平的變化對腸黏膜屏障功能的的影響。
　　主要結果：
　　1.I/R條件下腸粘膜A2BAR表達量明顯升高,術后6h達到峰值;I/R條件下腸道緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA及蛋白水平都下降,腸粘膜TER值降低;而A2BAR特異性抑制劑PSB1115干預后,Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA及蛋白表達水平較單純I/R組增多,且腸粘膜TER值升高。
　　2.單純?nèi)毖蹩梢?/p>

11、刺進體外培養(yǎng)腸上皮Caco-2細胞A2BAR表達量增加;缺氧引起緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA及蛋白表達水平下降,并且緊密連接結構破壞,同時上皮細胞TER明顯降低;而A2BAR特異性抑制劑PSB1115緩解了缺氧條件引起的腸上皮屏障功能損害,腸上皮細胞緊密連接蛋白表達增多,且促進跨上皮電阻TER恢復。
　　3.缺氧條件下cAMP水平升高,抑制cAMP水平可增加腸道緊密連接蛋白claudin-1及

12、occludin mRNA及蛋白水平的表達;且缺氧條件下cAMP水平的下調,可以減少缺氧對腸上皮屏障的損傷。
　　結論：
　　1、I/R條件下腸粘膜A2BAR表達明顯增加;Claudin-1、Occludin和ZO-1表達降低;腸粘膜跨上皮電阻明顯降低;I/R條件下抑制A2BAR表達,Claudin-1、Occludin和ZO-1表達增多,且促進了腸粘膜跨上皮電阻升高。提示I/R條件下A2BAR通過調控腸上皮間緊密連接蛋白的

13、表達及功能來影響腸上皮屏障功能。
　　2.缺氧條件下腸上皮A2BAR表達明顯增加;缺氧造成Claudin-1、Occludin和ZO-1表達降低,結構出現(xiàn)破壞;同時造成腸上皮細胞跨上皮電阻降低。缺氧條件下抑制A2BAR表達,可以引起緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1表達增多,緩解了緊密連接蛋白結構的破壞,同時腸上皮細胞跨上皮電阻TER明顯增高。
　　3、常氧條件下腸上皮細胞cAMP表達較少,缺氧能顯著