A2BAR在調(diào)控缺氧誘導(dǎo)腸粘膜屏障損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　腸粘膜屏障是機(jī)體的重要屏障結(jié)構(gòu),包括機(jī)械屏障、免疫屏障、生物屏障和化學(xué)屏障。其中機(jī)械屏障是最重要,也是最基礎(chǔ)的屏障結(jié)構(gòu)。各種急、慢性病理情況,如外科手術(shù)應(yīng)激、戰(zhàn)創(chuàng)傷、燒傷、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)、缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)和全胃腸外營(yíng)養(yǎng)(total parenteral nutrition,TPN)等均可導(dǎo)致腸粘膜屏障損傷,引

2、發(fā)內(nèi)毒素、細(xì)菌入血,進(jìn)而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SystemicInflammatory Response Syndrome,SIRS),最終導(dǎo)致導(dǎo)致多臟器功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS)。盡管目前針對(duì)不同病理?xiàng)l件下腸粘膜屏障功能的調(diào)控機(jī)制做了大量研究工作,但在急、慢性病理?xiàng)l件下腸粘膜損傷及損傷后修復(fù)機(jī)制尚未闡明。
　　腺苷(Adenosine,Ado)是腺嘌呤核苷酸的前

3、體和代謝產(chǎn)物,作為一種神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì),廣泛分布于全身各系統(tǒng)及組織,調(diào)節(jié)著多種重要的生理及病理過(guò)程。在炎癥反應(yīng)、凝血過(guò)程、I/R或缺氧的條件下,細(xì)胞外腺苷濃度高度聚集,通過(guò)激活并結(jié)合細(xì)胞膜上的與G蛋白偶聯(lián)的腺苷受體(Adenosine Receptor,AR),從而啟動(dòng)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)到過(guò)程。目前已發(fā)現(xiàn)AR有4種亞型,并已被成功克隆AR分為A1,A2A,A2B,A3腺苷受體。A1受體與Gi/G0蛋白偶聯(lián),A3受體與Gi蛋白偶聯(lián),抑制腺苷酸環(huán)

4、化酶(adenylate cyclase,AC)的活性,減少環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的水平;A2A、A2B與Gs蛋白偶聯(lián),激活A(yù)C的活性,增加cAMP的水平。低濃度的腺苷即可激活A(yù)2A受體,而只有較高濃度的腺苷才能激活A(yù)2B受體,提示在生理狀態(tài)下基礎(chǔ)水平的腺苷主要激活A(yù)2A受體,當(dāng)腺苷水平上升超過(guò)生理水平或達(dá)到病理水平時(shí)A2B受體才被激活[2,3]。
　　A2B受體(Adenosine A2B receptor,A2BAR)參與調(diào)節(jié)

5、機(jī)體多種生理及病理過(guò)程,包括活化肥大細(xì)胞、抑制血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、舒張血管、調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放、調(diào)節(jié)腸道氯離子分泌等[4,5,6,7,8]。研究發(fā)現(xiàn),急性缺血和缺氧條件可以誘發(fā)腸道A2BAR高表達(dá)[9],進(jìn)而參與調(diào)節(jié)缺血和缺氧對(duì)腸粘膜的損傷后修復(fù)的過(guò)程。而在IBD模型中,A2BAR/KO小鼠腸道損傷較WT小鼠輕,且A2BAR通過(guò)加強(qiáng)巨噬細(xì)胞分泌IL-6而起到促進(jìn)腸道炎癥作用[10]。對(duì)于A2BAR的在急、慢性病理?xiàng)l件

6、中如何參與調(diào)控腸粘膜屏障功能的研究,目前仍不明確。因此,本課題擬建立I/R小鼠模型及體外腸粘膜屏障模型,應(yīng)用蛋白印跡、激光共聚焦、U氏灌流系統(tǒng)、跨上皮電阻測(cè)定、RT-PCR等技術(shù),探討I/R條件下A2BAR的激活及失活對(duì)維持腸粘膜屏障功能關(guān)鍵的分子Claudin-1、Occludin、ZO-1等的表達(dá)及結(jié)構(gòu)的變化。并通過(guò)U氏灌流系統(tǒng)及跨上皮電阻技術(shù)測(cè)定跨上皮電阻(TER),明確I/R條件及缺氧條件下A2BAR的激活與失活對(duì)腸粘膜屏障的調(diào)

7、控機(jī)制,為腸粘膜屏障損傷及修復(fù)機(jī)制提供新的思路。
　　方法：
　　1.建立小鼠腸道I/R損傷模型,通過(guò)免疫組織化學(xué)、蛋白印跡、RT-PCR及U氏灌流系統(tǒng)技術(shù),測(cè)定小鼠腸粘膜中A2BAR的表達(dá);利用阻斷劑PSB1115抑制A2BAR表達(dá)后,觀察Claudin-1、Occludin、ZO-1mRNA、蛋白表達(dá)水平及腸粘膜跨上皮電阻,了解I/R條件下A2BAR的失活如何影響腸粘膜緊密連接蛋白的表達(dá)及腸屏障功能。
　　2.建立

8、腸上皮細(xì)胞系Caco-2缺氧及A2BAR抑制劑PSB1115干預(yù)模型,通過(guò)transwell小室培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞、跨上皮電阻(TER測(cè)定技術(shù),了解缺氧及PSB1115(A2BAR特異性抑制劑)干預(yù)情況下TER的變化情況。通過(guò)蛋白印跡、RT-PCR、激光共聚焦技術(shù),檢測(cè)常氧、缺氧及缺氧條件下PSB1115干預(yù)對(duì)腸上皮Claudin-1、Occludin、ZO-1表達(dá)及結(jié)構(gòu)的影響。
　　3.建立腸上皮細(xì)胞系Caco-2模型,采用人結(jié)腸癌

9、Caco-2細(xì)胞建立腸上皮細(xì)胞缺氧模型,分為常氧組、常氧加Forskolin(腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑作用)組、缺氧8h組、缺氧8h加SQ22536(腺苷酸環(huán)化酶抑制劑)組;采用cAMP檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組缺氧前后cAMP水平的變化;RT-PCR及Western-blot方法分別檢測(cè)各組腸上皮緊密連接蛋白claudin-1及occludinm RNA和蛋白表達(dá)水平的變化;檢測(cè)各組腸上皮TER的變化情況。探討缺氧條件下環(huán)磷酸腺苷(cAMP)

10、水平的變化對(duì)腸黏膜屏障功能的的影響。
　　主要結(jié)果：
　　1.I/R條件下腸粘膜A2BAR表達(dá)量明顯升高,術(shù)后6h達(dá)到峰值;I/R條件下腸道緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA及蛋白水平都下降,腸粘膜TER值降低;而A2BAR特異性抑制劑PSB1115干預(yù)后,Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA及蛋白表達(dá)水平較單純I/R組增多,且腸粘膜TER值升高。
　　2.單純?nèi)毖蹩梢?/p>

11、刺進(jìn)體外培養(yǎng)腸上皮Caco-2細(xì)胞A2BAR表達(dá)量增加;缺氧引起緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA及蛋白表達(dá)水平下降,并且緊密連接結(jié)構(gòu)破壞,同時(shí)上皮細(xì)胞TER明顯降低;而A2BAR特異性抑制劑PSB1115緩解了缺氧條件引起的腸上皮屏障功能損害,腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)增多,且促進(jìn)跨上皮電阻TER恢復(fù)。
　　3.缺氧條件下cAMP水平升高,抑制cAMP水平可增加腸道緊密連接蛋白claudin-1及

12、occludin mRNA及蛋白水平的表達(dá);且缺氧條件下cAMP水平的下調(diào),可以減少缺氧對(duì)腸上皮屏障的損傷。
　　結(jié)論：
　　1、I/R條件下腸粘膜A2BAR表達(dá)明顯增加;Claudin-1、Occludin和ZO-1表達(dá)降低;腸粘膜跨上皮電阻明顯降低;I/R條件下抑制A2BAR表達(dá),Claudin-1、Occludin和ZO-1表達(dá)增多,且促進(jìn)了腸粘膜跨上皮電阻升高。提示I/R條件下A2BAR通過(guò)調(diào)控腸上皮間緊密連接蛋白的

13、表達(dá)及功能來(lái)影響腸上皮屏障功能。
　　2.缺氧條件下腸上皮A2BAR表達(dá)明顯增加;缺氧造成Claudin-1、Occludin和ZO-1表達(dá)降低,結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞;同時(shí)造成腸上皮細(xì)胞跨上皮電阻降低。缺氧條件下抑制A2BAR表達(dá),可以引起緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1表達(dá)增多,緩解了緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)的破壞,同時(shí)腸上皮細(xì)胞跨上皮電阻TER明顯增高。
　　3、常氧條件下腸上皮細(xì)胞cAMP表達(dá)較少,缺氧能顯著