和血生絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠血管新生的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究表明，腦血管閉塞以后，缺血區(qū)出現(xiàn)血管增生，其增生的范圍和程度直接關(guān)系到半暗帶血流的改善，影響神經(jīng)元生理功能的恢復(fù)除對(duì)缺血區(qū)現(xiàn)有的微血管結(jié)構(gòu)功能的完整性給予保護(hù)之外，還需促進(jìn)治療性血管的新生以加強(qiáng)對(duì)缺血區(qū)的血流供應(yīng)，挽救損傷的腦組織。腦缺血后的血管新生可被一系列血管生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)。血管生成生長(zhǎng)因子具有正性調(diào)控作用，包括內(nèi)皮細(xì)胞特異性的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）家族、血管生成素（Ang）家族等。VEGF/VEGFR系統(tǒng)可能在啟動(dòng)血管新生

2、中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，是整個(gè)腦缺血后血管新生調(diào)控的中心環(huán)節(jié)。而Ang及其受體家族被認(rèn)為是最重要的血管穩(wěn)定因子，它們抑制血管內(nèi)皮系統(tǒng)（ECS）的增殖。
　　 腦缺血再灌注會(huì)導(dǎo)致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，通透性明顯增高，血腦屏障嚴(yán)重破壞，是引起腦水腫最常見(jiàn)原因之一，研究對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用的藥物及方法具有重要的臨床意義。
　　 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為缺血性腦血管疾病屬于“中風(fēng)病”、“卒中”等范疇。我們認(rèn)為中風(fēng)的病機(jī)為氣血失和、腦絡(luò)

3、失養(yǎng)，因此提出和血生絡(luò)法治療中風(fēng)的觀點(diǎn)，以人參養(yǎng)榮湯化裁為和血生絡(luò)方，在臨床當(dāng)中治療缺血性腦血管病取得了良好的療效。
　　 目的：將和血生絡(luò)方用于大鼠局灶性腦缺血再灌注（MCAO/IR）模型，觀察其對(duì)對(duì)腦組織血管生成生長(zhǎng)因子、血管生成素-1（Ang-1）及其受體（Tie-2）表達(dá)、大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦含水量的影響，探討和血生絡(luò)方對(duì)缺血性腦損傷后血管新生作用及其機(jī)制，同時(shí)觀察其對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性、VEGFmRNA

4、的影響，為和血生絡(luò)方治療腦梗塞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：研究?jī)?nèi)容共分四部分。
　　 第一部分：和血生絡(luò)方對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織微血管密度和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的影響
　　 健康Wistar大鼠，體重250～300g。將大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、和血生絡(luò)方組，參照文獻(xiàn)，后兩組線(xiàn)栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞局灶性腦缺血再灌注模（MCAO/IR）模型，大鼠腹腔注射10％的水合氯醛（350mg/kg體重）

5、麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部正中切口，暴露分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）和頸外動(dòng)脈（ECA），結(jié)扎CCA ECA根部及分支。用動(dòng)脈夾夾閉CCA遠(yuǎn)心端，在CCA近分叉處剪一小口，經(jīng)此插入直徑0.2mm頭端圓鈍的漁線(xiàn)，插入深度為18.5±0.5mm。結(jié)扎頸總動(dòng)脈，縫合皮膚。2h后抽出尼龍線(xiàn)栓，建立腦IR模型。假手術(shù)組只分離、暴露血管，不結(jié)扎頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，不插入尼龍魚(yú)線(xiàn)。參照Z(yǔ)ea Longa5分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能

6、完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾斜；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。1～3分大鼠為合格，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。
　　 各組大鼠屆時(shí)以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，打開(kāi)胸腔，經(jīng)心臟灌注0.9％的生理鹽水，續(xù)之以4％多聚甲醛灌流固定。剝?nèi)∧X組織，以視交叉到枕葉處兩點(diǎn)冠狀切片。
　　 免疫組化步驟：P V法染色，染色步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，Ⅷ因子、VEGF的濃度均為1：100，DAB顯色。胞漿有棕黃色或棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。

7、r>　　 微血管密度：凡染成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞族作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，參照Weidener計(jì)數(shù)方法，計(jì)算出每1 m㎡面積內(nèi)微血管的數(shù)量，即微血管密度，然后求其均值。
　　 數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用SPSS for Windows10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)，顯著性差異水平以0.05和0.01.為標(biāo)準(zhǔn)。
　　 第二部分：和血生絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠血管生成素-1及其受體表達(dá)的影響<

8、br>　　 動(dòng)物分組、造模方法及免疫組化步驟同上。
　　 第三部分：和血生絡(luò)法對(duì)缺氧大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性和VEGFmRNA的影響
　　 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)：取1周內(nèi)Wistar大鼠，無(wú)菌條件下取出大腦，放入預(yù)冷D hank's液中，剝離軟腦膜、大血管及大腦髓質(zhì)，用眼科剪將大腦皮質(zhì)剪碎成1mm3的小塊，移入勻漿器中勻漿，將勻漿液依次通過(guò)100目和200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，收集200目尼龍網(wǎng)上的微血管段。用0.2％膠

9、原酶37℃消化20min。離心所得沉淀用DMEM液懸浮后，接種于明膠預(yù)先包被的培養(yǎng)瓶中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
　　 本實(shí)驗(yàn)用第3代細(xì)胞，分為正常組及缺氧組，缺氧組建立缺氧模型：將細(xì)胞移入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中（37℃，95％N2，5％CO2）造成缺氧模型。和血生絡(luò)方組在造模時(shí)分別給予大、中、小劑量的和血生絡(luò)方中藥；采用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞活性，用RT-PCR方法測(cè)定VEGFmRNA。
　　 第四部分：和血生絡(luò)方對(duì)腦

10、缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦含水量的影響
　　 1.大鼠一般狀況的比較：和血生絡(luò)方能顯著改善腦缺血再灌注后大鼠的一般狀況：明顯改善大鼠的活動(dòng)、皮毛光澤度、飲食等狀況。
　　 2.神經(jīng)功能評(píng)分：采用Longa5分評(píng)分神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組腦缺血再灌注后大鼠進(jìn)行經(jīng)功能評(píng)分。
　　 3.腦含水量的測(cè)定：動(dòng)物處死后，取出全腦，去除嗅腦，低位腦于及小腦，立即稱(chēng)取腦濕重，后置于90℃烤箱將組織塊烤至恒重，測(cè)干重。計(jì)算腦

11、含水量=（濕重-干重）/濕重×100％。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：和血生絡(luò)方對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織微血管密度和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的影響
　　 1.和血生絡(luò)方對(duì)腦缺血大鼠后微血管密度的影響
　　 正常組和假手術(shù)組MVD比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。自7天開(kāi)始，模型組與和血生絡(luò)方組缺血周邊區(qū)微血管計(jì)數(shù)明顯增多。和血生絡(luò)組皮層缺血周邊區(qū)微血管計(jì)數(shù)又明顯多于模型組。
　　 2.和血生絡(luò)方對(duì)腦缺血大鼠V

12、EGF表達(dá)的影響
　　 正常組和假手術(shù)組VEGF表達(dá)較弱。模型組第1d時(shí)見(jiàn)少量VEGF表達(dá)，與正常組相比，3d后模型組VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多。與模型組比較，和血生絡(luò)方組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)更多，第7d時(shí)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，表達(dá)細(xì)胞主要為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。在14d時(shí)模型組與和血生絡(luò)方組VEGF表達(dá)開(kāi)始下降，在第21d時(shí)仍有陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，仍未恢復(fù)到正常水平。
　　 第二部分：和血生絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠血

13、管生成素-1及其受體表達(dá)的影響
　　 正常組和假手術(shù)組Ang-1表達(dá)較弱。模型組第1d時(shí)見(jiàn)少量表達(dá)，與正常組比較，3d后模型組Ang-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多。與模型組比較，在14d時(shí)和血生絡(luò)組Ang-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多。Tie-2的表達(dá)特點(diǎn)與Ang-1相似。
　　 第三部分：和血生絡(luò)法對(duì)缺氧大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性和VEGFmRNA的影響
　　 1.和血生絡(luò)方對(duì)缺氧后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響
　　 與正

14、常組比較，模型組細(xì)胞活性明顯下降，表明缺氧可誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞造成比較嚴(yán)重的損傷。與模型組比較，和血生絡(luò)方各劑量組細(xì)胞活性均明顯增強(qiáng)。
　　 2.和血生絡(luò)方對(duì)缺氧后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA的影響
　　 與正常組比較，模型組細(xì)胞VEGFmRNA明顯增高。與模型組比較，和血生絡(luò)方后小劑量、中劑量VEGFmRNA的表達(dá)增強(qiáng)。大劑量組增高更明顯。
　　 第四部分：和血生絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能和腦含水量的影響

15、
　　 1.和血生絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能的影響
　　 正常組與假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)正常，評(píng)分均為0分。模型組神經(jīng)學(xué)評(píng)分多數(shù)為2分以上。與模型組比較，和血生絡(luò)方組在第7天時(shí)評(píng)分明顯降低。
　　 2.和血生絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能的影響
　　 模型組3d時(shí)的腦含水量達(dá)到高峰，在7d時(shí)腦含水量仍未恢復(fù)正常。與模型組比較，和血生絡(luò)方組的腦含水量在3d和7d時(shí)明顯下降。假手術(shù)組的腦含水

16、量與正常組比較均無(wú)明顯差異，表明手術(shù)本身對(duì)大鼠腦含水量無(wú)明顯影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.和血生絡(luò)方可使腦缺血周邊區(qū)MVD表達(dá)增強(qiáng)，使血管數(shù)目增多?？纱龠M(jìn)VEGF表達(dá)，第7d時(shí)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，表達(dá)細(xì)胞主要為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。提示有促進(jìn)缺血區(qū)的血管新生的作用。
　　 2.和血生絡(luò)方可提高Ang-1和Tie-2表達(dá)，有促進(jìn)缺血區(qū)的血管新生的作用，14d時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，在血管形成后期具有非常重要