突變分析NHA2在酵母中的功能及其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和小鼠中的表達(dá)作用研究.pdf

1、體外實(shí)驗(yàn)表明，鈉-氫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(NHA2)高選擇性地表達(dá)于破骨細(xì)胞，在破骨細(xì)胞分化、成熟、凋亡、骨吸收等過程中發(fā)揮重要作用。在對(duì)其細(xì)菌同源物NhaA進(jìn)行的突變研究分析表明，有一些氨基酸殘基對(duì)NHaA功能起著關(guān)鍵的作用，這些位點(diǎn)在進(jìn)化上非常保守，不僅在細(xì)菌Nha中很重要，在真核生物NHA2中也起著非常重要的作用。
　　 我們首先采用對(duì)鹽敏感型的釀酒酵母Saccharomjrces cerevisiae BW3 la菌株來異源表達(dá)人

2、源鈉-氫交換蛋白2(HsNHA2)及其一系列突變體。用不同NaCI濃度的YNB固體瓊脂平板和YNB液體培養(yǎng)基來研究表達(dá)HsNHA2及其突變體的酵母細(xì)胞表型生長(zhǎng)特征，找出對(duì)HsNHA2鹽離子載體發(fā)揮作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，為我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)破骨細(xì)胞維持內(nèi)外離子濃度的平衡機(jī)制打下基礎(chǔ)。繼而我們用細(xì)胞因子RNAKL來誘導(dǎo)RAW246.7細(xì)胞株分化成破骨樣細(xì)胞；用RANKL和M-CSF聯(lián)合作用誘導(dǎo)人外周血CD14+分化為成熟破骨細(xì)胞，來分別檢測(cè)分析在誘導(dǎo)

3、的不同階段，NHA2的表達(dá)發(fā)生的變化，從而說明NHA2在破骨細(xì)胞正常分化成熟中所起的作用。最后我們用NHA2基因敲除小鼠模型，觀察小鼠在沒有NHA2表達(dá)的情況下生長(zhǎng)表型會(huì)發(fā)生的變化。從而來揭示NHA2在高等生物正常生長(zhǎng)中所起的作用。
　　 我們發(fā)現(xiàn)HsNHA2278和279位點(diǎn)的精氨酸殘基任何一個(gè)突變都會(huì)完全使BW3la菌株失去了耐受鹽的功能，說明這兩個(gè)殘基對(duì)HsNHA2發(fā)揮離子載體功能至關(guān)重要。而F357和F437位點(diǎn)的雙突變

4、會(huì)使酵母不能在0.4MNaCl的溶液中生長(zhǎng)，表明這些殘基也是對(duì)其鹽載體功能是非常重要的。G2-V187和S107-L115位點(diǎn)的任何一個(gè)缺失突變都使得菌株不能存活于0.2MNaCl中，表明這些區(qū)域?qū)HA2的功能都是必須的。從D278C和D279C單突變能部分地互補(bǔ)其功能來看，NHA2可能會(huì)形成二聚體來行使其離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能。用破骨細(xì)胞體外分化系統(tǒng)，我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞因子RANKL誘導(dǎo)RAW264.7成破骨細(xì)胞的不斷成熟的過程中，NHA2表達(dá)不

5、斷增高。NHA2可在誘導(dǎo)2天后檢測(cè)出來,5天后達(dá)到頂峰，說明NHA2表達(dá)在破骨細(xì)胞分化晚期。NHA2基因敲除小鼠生長(zhǎng)表型與野生型差異不顯著，但在體外提取骨髓誘導(dǎo)成破骨細(xì)胞過程中，NHA2基因敲出小鼠骨髓細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞的能力比野生型弱，說明NHA2在一定程度上作用于破骨細(xì)胞，影響其正常分化成熟。
　　 總之，我們的發(fā)現(xiàn)為轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究提供了除NHE和NhaA之外的的另一個(gè)很好的模板。NHA2作為一種不太被人了解的、但廣泛存在的