MiR-135b在骨肉瘤復(fù)發(fā)和肺轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的:骨肉瘤是兒童青少年中最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤。其治療常因?yàn)槟[瘤出現(xiàn)耐藥、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)而失敗。即使是較為激進(jìn)的治療方案也無法保證患者的長期生存，目前患者的5年總體生存率停滯在60-80％已有三十余年。越來越多的證據(jù)顯示腫瘤干細(xì)胞可能是腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因之一，而Notch和Wnt/β-catenin信號通路對于維持腫瘤干細(xì)胞的自我更新、耐藥和再生等干性又至關(guān)重要。最新研究表明，這兩種信號通路在腫瘤干細(xì)胞中均處于激活狀態(tài)，其部分

2、原因正是由于某種miRNA的失調(diào)。MiR-135b被發(fā)現(xiàn)在包括骨肉瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中呈異常表達(dá)，且某些腎小球腎病研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)MiR-135b可激活Wnt/β-catenin信號通路。還有研究顯示，在成骨細(xì)胞中，已激活的Wnt/β-catenin通路可以激活Notch通路?；谝陨媳尘?，本研究的目的是，探索miR-135b異常表達(dá)對骨肉瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的影響，以及其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制，為未來可能的靶向治療提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　方法

3、:第一部分:①分別對骨肉瘤原發(fā)灶和肺轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本，以及高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系（LM-5和M132）和低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系（Saos-2和HuO9）中的miR-135b表達(dá)進(jìn)行了定量檢測對比。觀察不同組織標(biāo)本及細(xì)胞系之間miR-135b表達(dá)水平的差異。②通過細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，觀察miR-135b表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響。并利用miR-135b過表達(dá)Saos-2細(xì)胞和正常Saos-2細(xì)胞建立動物模型，觀察miR-135b表達(dá)對骨

4、肉瘤肺轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的影響。第二部分:①對骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞和普通骨肉瘤細(xì)胞中的miR-135b表達(dá)進(jìn)行檢測、對比，觀察兩者之間的差異。同時(shí)對普通骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)miR-135b干預(yù)，觀察其對腫瘤干細(xì)胞干性的影響。②分別對miR-135b過表達(dá)骨肉瘤細(xì)胞和移植瘤組織中，Notch信號通路下游蛋白HES1的表達(dá)和Wnt/β-catenin通路的活性進(jìn)行對比觀察。同時(shí)觀察miR-135b沉默的骨肉瘤細(xì)胞中，HES1和β-catenin表達(dá)的變

5、化。③構(gòu)建Notch1和/或β-catenin沉默的Saos-2骨肉瘤細(xì)胞系，觀察調(diào)控Notch和Wnt/β-catenin信號通路對骨肉瘤細(xì)胞中miR-135b的生物學(xué)功能影響。④使用靶向掃描V6.2計(jì)算算法(miRanda and miRDB)對miR-135b潛在的靶向基因進(jìn)行篩查。對TET3、GSK3β、β-TrCP、CK1α和APC等可能的靶基因在miR-135b沉默和過表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，觀察

6、它們的表達(dá)水平與Wnt/β-catenin及Notch信號通路之間的關(guān)系。⑤分別將含野生型3'UTR和突變型3'UTR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到不同miR-135b表達(dá)的Saos-2和HuO9細(xì)胞中，使用RNA免疫沉淀反應(yīng)(RIP)和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測，探索miR-135b靶基因的結(jié)合與否。⑥將miR-135b的靶基因轉(zhuǎn)染到miR-135b過表達(dá)的Saos-2和HuO9細(xì)胞中，通過測量Wnt/β-catenin通路活性和Notch信號通路相關(guān)蛋白的

7、表達(dá)，觀察TET3等靶基因是否直接與miR-135b誘導(dǎo)的Notch和Wnt/β-catenin信號通路激活相關(guān)。⑦在動物試驗(yàn)中，觀察不同miR-135b表達(dá)對腫瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)成瘤的影響，并按單獨(dú)注射順鉑或聯(lián)合使用順鉑和miR-135b抑制劑，將裸鼠分為對照組和試驗(yàn)組，觀察兩組之間療效的差異。第三部分:①對112例骨肉瘤患者標(biāo)本的miR-135b表達(dá)水平與生存之間的關(guān)系進(jìn)行了評估。②對骨肉瘤標(biāo)本中的miR-135b及其靶向基因之間的表達(dá)水

8、平及相互間關(guān)系進(jìn)行了分析。
　　結(jié)果:第一部分:①M(fèi)iR-135b在骨肉瘤組織中呈高表達(dá)。骨肉瘤腫瘤組織和骨肉瘤細(xì)胞系中的miR-135b表達(dá)顯著高于正常骨和正常成骨細(xì)胞。骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本中，miR-135b的表達(dá)比原發(fā)灶標(biāo)本要顯著提升;高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系（LM-5和M132）中，miR-135b的表達(dá)比低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系（Saos-2和HuO9）中顯著提高。②MiR-135b過表達(dá)可刺激骨肉瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。過表達(dá)miR-13

9、5b可在體外實(shí)驗(yàn)中顯著提升MG63和Saos-2細(xì)胞的遷移和侵襲能力。更為重要的是，在裸鼠動物實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)miR-135b可以誘導(dǎo)Saos-2細(xì)胞轉(zhuǎn)移到肺，而對照組的Saos-2細(xì)胞并不誘導(dǎo)肺轉(zhuǎn)移。miR-135b表達(dá)更高的腫瘤在順鉑治療后，很快又開始生長，而miR-135b正常表達(dá)的腫瘤則在治療后30天內(nèi)未再出現(xiàn)生長。第二部分:①M(fèi)iR-135b過表達(dá)可提高骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞干性。在CD133和ALDH1陽性的Saos-2細(xì)胞和HuO

10、9細(xì)胞中，miR-135b的表達(dá)要遠(yuǎn)高于CD133和ALDH1陰性的細(xì)胞。過表達(dá)miR-135b與正常miR-135b表達(dá)對照組相比，可以顯著地增加CD133和ALDH1陽性的Saos-2細(xì)胞和HuO9細(xì)胞亞群數(shù)量。②過表達(dá)miR135b可通過激活Notch and Wnt/β-catenin通路提高骨肉瘤細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性。在miR-135b過表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞中，Notch信號通路下游蛋白HES1的表達(dá)和Wnt/β-catenin通

11、路的活性均比對照組細(xì)胞顯著上升。miR-135b過表達(dá)還可增加β-catenin在Saos-2和HuO9細(xì)胞核中的積累。在miR-135b過表達(dá)的Saos-2細(xì)胞形成的移植瘤組織中，HES1和β-catenin的表達(dá)同樣高于對照組。在miR-135b沉默的MNHG/HOS細(xì)胞中，HES1和β-catenin表達(dá)與對照組相比受到抑制。③同時(shí)敲除Notch和β-catenin可以更有效地抑制miR-135b過表達(dá)誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞的干性和轉(zhuǎn)移

12、。MiR-135b過表達(dá)組中腫瘤干細(xì)胞亞群比例最高，Notch1或β-catenin沉默組的腫瘤干細(xì)胞比例有所下降，Notch1和β-catenin同時(shí)沉默組的腫瘤干細(xì)胞比例最低。④骨肉瘤細(xì)胞中miR-135b表達(dá)與其靶基因TET3、GSK3β、β-TrCP、CK1α和APC的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。TET3、GSK3β、β-TrCP、CK1α和APC的mRNA和蛋白表達(dá)水平在miR-135b沉默的MNNG/HOS細(xì)胞中均顯著升高。⑤miR-13

13、5b直接與靶基因的3'非編碼區(qū)相結(jié)合。在miR-135b過表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞中，包含原型3'UTR的質(zhì)粒的熒光素酶活性顯著減低。但含突變3'UTR的質(zhì)粒的熒光素酶活性并不發(fā)生變化。⑥MiR-135b通過TET3等靶基因激活Notch和Wnt/β-catenin信號通路。單獨(dú)轉(zhuǎn)染TET3、CK1α、β-TrCP、APC和GSK3β可以部分抑制miR-135b過表達(dá)骨肉瘤細(xì)胞中miR-135b誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號通路激活。⑦抑

14、制miR-135b可以有效抑制裸鼠體內(nèi)骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞導(dǎo)致的肺轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。抑制miR-135b可完全抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤形成，而對照組并沒有影響到腫瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤形成。單獨(dú)使用順鉑治療，可使腫瘤縮小，但在治療結(jié)束12天后出現(xiàn)復(fù)發(fā)。而聯(lián)合使用順鉑和miR-135b抑制劑進(jìn)行治療組未出現(xiàn)復(fù)發(fā)。在治療4個(gè)周期之后，聯(lián)合治療組與單獨(dú)使用順鉑治療組及對照組相比，腫瘤干細(xì)胞的數(shù)量顯著下降。第三部分:①M(fèi)iR-135b高表達(dá)是患者預(yù)后

15、不良的危險(xiǎn)因素。miR-135b表達(dá)水平高的腫瘤患者總體生存率和無病生存率均低于miR-135b低水平組。②MiR-135b與TET3、CK1α和GSK3β之間呈明顯負(fù)相關(guān)，而與Notch1和β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)。Notch1和/或β-catenin的高表達(dá)與骨肉瘤患者預(yù)后較差呈強(qiáng)相關(guān)性。但與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，miR-135b與APC和β-TrCP之間并不存在相關(guān)。
　　結(jié)論:①miR-135b在骨肉瘤組織中呈異常高表