miR-195在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的功能及作用機制研究.pdf

1、骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年的最常見的骨的惡性腫瘤，約40％左右的病例出現(xiàn)的遠隔轉(zhuǎn)移（主要為肺轉(zhuǎn)移），是導(dǎo)致治療失敗和死亡的最主要原因，因此尋找新的有效的骨肉瘤的早期診斷工具及治療方法極為迫切。
　　miRNA是一類在真核生物中發(fā)現(xiàn)的非編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，其大小約為22-25nt，可以通過堿基互補配對的方式識別靶基因mRNA，使其直接降解或翻譯抑制，從而達到基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。研究表明，miRNA參與多種腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控，可能起

2、到轉(zhuǎn)移激活物或抑制物的作用。同時由于其表達具有高度組織特異性、保守性和時序性，miRNA被視為一種新的相對特異的腫瘤轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志物。miRNA可作為特異性腫瘤轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志物的特性，同樣為骨肉瘤轉(zhuǎn)移的診斷和治療提供了新的希望，但是，目前國內(nèi)外關(guān)于骨肉瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性miRNA的研究卻非常有限。
　　本實驗室長期開展骨腫瘤的基礎(chǔ)研究，在自行建立的兩株來自同一母系但具有不同轉(zhuǎn)移潛能的骨肉瘤細胞系F4和F5M2的基礎(chǔ)上，利用miRNA芯片對其

3、進行表達譜的分析，初步篩選出8個差異表達的miRNA。這些差異表達的miRNA能否成為特異性的骨肉瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性標(biāo)志物，還有待于進一步的驗證和研究。
　　研究目的：
　　本實驗前期研究基礎(chǔ)上，以在高轉(zhuǎn)移潛能骨肉瘤細胞系F5M2中呈低表達狀態(tài)的has-miR-195為研究對象，研究其在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的功能和作用機制，明確其可能作用的靶基因，并探索miR-195及其靶基因作為骨肉瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)生物標(biāo)記物和治療靶點的可能性。
　　研

4、究方法：
　　1.采用TaqMan?探針實時定量PCR分析的方法，對利用miRNA芯片篩選出來的在不同轉(zhuǎn)移潛能的骨肉瘤細胞系F4和F5M2中差異表達的miR-195進行驗證。
　　2.構(gòu)建表達miR-195的pSilencer4.1-CMV載體，用其轉(zhuǎn)染F5M2細胞，并用G418篩選出穩(wěn)定上調(diào)miR-195表達水平的骨肉瘤細胞系及其對照組細胞系。
　　3.利用構(gòu)建的上調(diào)miR-195表達水平的骨肉瘤細胞系F5M2+mi

5、R-195，進行miR-195的功能獲得型研究。在體外水平，觀察F5M2+miR-195細胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲能力；在裸鼠體內(nèi)，觀察F5M2+miR-195細胞的原位成瘤能力和肺轉(zhuǎn)移能力。
　　4.利用三個不同的生物信息學(xué)軟件對miR-195進行靶基因的預(yù)測分析，并對照不同轉(zhuǎn)移潛能骨肉瘤細胞系F4和F5M2之間差異表達的47個基因，篩選出miR-195的潛在靶基因，然后分別從基因水平和蛋白水平對其進行驗證。
　　5.收

6、集不同轉(zhuǎn)移能力的臨床骨肉瘤樣本33例，分別利用實時定量PCR和免疫組織化學(xué)染色的方法檢測miR-195和FZD10的表達情況，并分析其表達趨勢與骨肉瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　研究結(jié)果：
　　1.Real-timeRT-PCR檢測結(jié)果顯示miR-195在F4和F5M2中差異表達，并且在F5M2中的表達較F4明顯降低。
　　2.成功構(gòu)建了miR-195的表達載體pSilencer-miR-195，并篩選出穩(wěn)定上調(diào)miR-195

7、表達水平的骨肉瘤細胞系F5M2+miR-195及其對照組細胞系F5M2+NC，Real-timeRT-PCR檢測顯示miR-195在F5M2+miR-195細胞中的表達較對照組明顯升高。
　　3.在體外水平，F(xiàn)5M2+miR-195細胞與F5M2+NC細胞相比，其增殖能力無明顯變化，細胞凋亡略有增加，細胞的遷移及侵襲能力明顯降低；在裸鼠體內(nèi)，F(xiàn)5M2+miR-195細胞的原位成瘤能力和肺轉(zhuǎn)移能力均明顯降低。
　　4.生物信息

8、學(xué)預(yù)測結(jié)合靶基因功能分析，篩選出miR-195的一個潛在靶基因FZD10。免疫細胞化學(xué)染色及westblotting結(jié)果顯示miR-195可以降低骨肉瘤細胞F5M2中FZD10的蛋白表達量，熒光素酶報告檢測系統(tǒng)結(jié)果顯示miR-195可以和FZD10的3’UTR的直接結(jié)合。
　　5.相比隨訪存活且未發(fā)生轉(zhuǎn)移組臨床骨肉瘤樣本，隨訪死亡或發(fā)生轉(zhuǎn)移組中miR-195的相對表達量明顯降低，而FZD10的蛋白表達量明顯增高。
　　研究結(jié)

9、論：
　　1.miR-195的表達趨勢與骨肉瘤細胞的轉(zhuǎn)移潛能呈負相關(guān)性，這就提示有必要對miR-195在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的功能及作用機制做進一步的研究。
　　2.成功構(gòu)建了穩(wěn)定上調(diào)miR-195表達水平的骨肉瘤細胞系F5M2+miR-195及其對照組細胞系F5M2+NC，為進行miRNA在骨肉瘤細胞中的功能獲得型研究提供了前提條件。
　　3.在體外水平，miR-195可以明顯地抑制骨肉瘤細胞F5M2的遷移和侵襲能力，同時具