microRNA-194在骨肉瘤中作用及機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　骨肉瘤是最常見的起源于間葉組織的原發(fā)性惡性腫瘤。其惡性程度高，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，致死率高。近年來，隨著輔助化療及外科技術(shù)的應(yīng)用及水平的提高，骨肉瘤的治療效果有了比較明顯的改善，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是難以解決的兩大問題。其中，骨肉瘤死亡患者80％-90%的死亡原因是由于發(fā)生了遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移（特別是肺轉(zhuǎn)移）。因此，探究骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制，尋找新的，有效的骨肉瘤的診療方法成為了骨肉瘤診療工作中的迫切需求。
　　miRNA的大小約2

2、1-23nt，是一類不參與翻譯轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)的單鏈小分子RNA。在轉(zhuǎn)錄后水平或翻譯水平，miRNA互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)mRNA從而對基因表達(dá)起到調(diào)控作用。從1993年被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，一千多種miRNA分子已被發(fā)現(xiàn)并深入研究。越來越多的研究證明，miRNA參與了一系列重要的生命過程進(jìn)程，包括生長，增殖，器官分化，程序性死亡和生長抑制等各個方面。其中，已有文獻(xiàn)報道，miRNA的表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)移有著極其重要的關(guān)系，同時又由于其表達(dá)具有高

3、度的時序性、保守性和組織特異性，故miRNA被認(rèn)為是一種新的有重要意義的腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。
　　miRNA-194在很多人類腫瘤，特別是消化道腫瘤中低表達(dá)，提示miRNA-194在人類腫瘤細(xì)胞中可能扮演抑癌基因的角色。但是，miRNA-194在人骨肉瘤中的作用及具體作用機(jī)制尚不明確。本實驗擬將miRNA-194作為本次研究的研究目標(biāo)和研究對象，尋找miRNA-194在兩種骨肉瘤細(xì)胞系SOSP-9607和U2-OS中所發(fā)揮

4、的作用，并對其作用機(jī)制進(jìn)行相關(guān)探索，并通過裸鼠及臨床樣本實驗進(jìn)行驗證和進(jìn)一步研究。
　　目的：
　　研究和探討miRNA-194在人骨肉瘤中的作用及其可能的作用機(jī)制，并從分子層面分析、比較miRNA-194分子對骨肉瘤生物學(xué)性狀的影響，從而為臨床對骨肉瘤進(jìn)行早期診斷和分子靶向治療提供理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)，從而為骨肉瘤相關(guān)轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的研究思路和實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　?。?）根據(jù)已有的基因芯片結(jié)果，使用熒光實時

5、定量PCR測定miRNA-194在來自同一母系細(xì)胞系但具有不同轉(zhuǎn)移潛能的骨肉瘤細(xì)胞系 F4和F5M2中含量，比較其差異，觀測其是否有統(tǒng)計學(xué)意義，從而為研究miRNA-194在骨肉瘤中轉(zhuǎn)移的作用提供依據(jù)；（2）在SOSP-9607和U2-OS兩種骨肉瘤細(xì)胞系中，利用構(gòu)建好的慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染和篩選，達(dá)到穩(wěn)定上調(diào)和下調(diào)miRNA-194表達(dá)量的目的。對照組設(shè)為2組，為空白病毒轉(zhuǎn)染對照（隨機(jī)病毒轉(zhuǎn)染）和空白（不轉(zhuǎn)染任何核苷酸）對照組。實驗共分

6、4組。（3）在SOSP-9607和U2-OS兩種骨肉瘤細(xì)胞系中，檢測miRNA-194對骨肉瘤細(xì)胞的增殖（MTT法，平板細(xì)胞克隆法）、周期（流式細(xì)胞儀法）、凋亡（流式細(xì)胞儀法）、轉(zhuǎn)移（transwell法，劃痕實驗法）等生物學(xué)特征的影響。（4）在動物實驗中（裸鼠實驗），研究和探討 miRNA-194在骨肉瘤的原位成瘤，特別是肺轉(zhuǎn)移中所起的重要作用。（5）在骨肉瘤臨床新鮮標(biāo)本和石蠟樣本中，測量miRNA-194及其靶基因的表達(dá)量，通過與臨

7、床相結(jié)合，觀察其與性別，腫瘤大小，轉(zhuǎn)移等指標(biāo)的關(guān)系，并通過生存分析等方法，觀察其與患者生存情況的關(guān)系。（6）通過三個主流的生物信息學(xué)網(wǎng)站，采集相關(guān)信息，預(yù)測和分析miRNA-194在人骨肉瘤中的作用機(jī)制（靶基因），使用熒光基因報告系統(tǒng)對可能的靶基因進(jìn)行驗證并進(jìn)一步從基因水平（實時定量PCR法）和蛋白水平（western法）進(jìn)行驗證。并通過免疫組化等方法進(jìn)一步證實miRNA-194和靶基因的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　?。?）熒光實

8、時定量PCR結(jié)果顯示：miRNA-194在F4和F5M2兩個細(xì)胞系中的表達(dá)量有明顯差異，且在轉(zhuǎn)移潛能高的F5M2中的含量明顯降低（p<0.01）。（2）通過熒光顯微鏡結(jié)果顯示，通過慢病毒轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選后，得到穩(wěn)定上調(diào)和下調(diào)miRNA-194的骨肉瘤細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染效率大于90%。實時定量PCR進(jìn)一步證實：經(jīng)轉(zhuǎn)染和篩選后，各組細(xì)胞實驗組中miRNA-194表達(dá)量有顯著差異（p<0.001）。（3）在體外水平，在SOSP-9607和U2-O

9、S中，miRNA-194表達(dá)量下調(diào)的細(xì)胞均增殖明顯加快，轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)，并且具有最低的 G0/G1期細(xì)胞比率和凋亡率（p<0.05）。（4）在裸鼠體內(nèi)，miRNA-194表達(dá)量升高的細(xì)胞的原位成瘤能力和肺轉(zhuǎn)移能力均明顯降低（p<0.05）。（5）通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行預(yù)測并結(jié)合靶基因的功能進(jìn)行分析，預(yù)測CDH2和IGF1R為miRNA-194可能的靶基因。利用熒光素酶基因報告實驗，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，miRNA-194的上調(diào)可以明顯降低

10、載有 CDH2和IGF1R基因3'-UTR的熒光報告基因的熒光強(qiáng)度，而下調(diào)可以明顯增強(qiáng)其強(qiáng)度。同時，Western blot檢測顯示CDH2和IGF1R相關(guān)的蛋白在miRNA-194含量變化的影響下均有明顯改變（p<0.05）。而在基因水平?jīng)]有明顯差異（p>0.05）。（6）通過107例新鮮骨肉瘤組織樣本（含瘤旁組織）與99例石蠟樣本檢測，結(jié)果測顯示，miRNA-194與年齡，腫瘤大小，轉(zhuǎn)移，是否存活等因素有關(guān)，并且和生存預(yù)后成明顯的負(fù)

11、相關(guān)。免疫組化顯示miRNA-194和CDH2、IGF1R基因有明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系（p<0.01）。
　　結(jié)論：
　?。?）miRNA-194在骨肉瘤細(xì)胞系中與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移潛能有密切關(guān)系。（2）成功構(gòu)建了能夠穩(wěn)定傳代的，過表達(dá)以及抑制表達(dá)miRNA-194的骨肉瘤細(xì)胞系，為進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)功能實驗奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。（3）在體外水平，miRNA-194發(fā)揮著抑癌基因的作用。miRNA-194可以顯著地促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡并對其

12、增殖和轉(zhuǎn)移能力起抑制作用。（4）在動物實驗中（裸鼠實驗），miRNA-194對骨肉瘤細(xì)胞的原位成瘤能力和肺轉(zhuǎn)移能力起到顯著的抑制作用。（5）預(yù)測并驗證了2個miRNA-194的靶基因：CDH2和IGF1R，從而對研究和解釋 miRNA-194在骨肉瘤中的作用機(jī)制提供了依據(jù)和新的思路。（6）在臨床標(biāo)本和石蠟樣本中，miRNA-194和年齡，腫瘤大小，轉(zhuǎn)移，是否存活等因素有關(guān)。并與骨肉瘤患者的生存預(yù)后呈明確的負(fù)相關(guān)關(guān)系。并進(jìn)一步驗證了miR