梅山豬visfatin，omentin和GNA14基因的克隆、染色體定位及其生物特性研究.pdf

1、梅山豬是我國(guó)優(yōu)秀地方豬種，是國(guó)內(nèi)外豬遺傳育種的重要品種資源，其重要功能基因的克隆、分析鑒定和生物學(xué)特性研究有助于積累和開(kāi)發(fā)利用我國(guó)重要地方豬種的基因資源信息，為優(yōu)良豬種的遺傳改良提供理論依據(jù)。 visfatin、omentin和GNA14基因編碼的蛋白在脂肪代謝信號(hào)調(diào)控中具有重要功能。本研究通過(guò)同源序列法，設(shè)計(jì)擴(kuò)增特異基因的引物；利用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增獲得特異基因的cDNA片段；采用3’RACE技術(shù)，獲取基因的3’末端cD

2、NA序列；通過(guò)基因組PCR獲取特異基因的基因組序列；利用輻射雜種板技術(shù)，對(duì)基因進(jìn)行染色體定位；并通過(guò)RT-PCR技術(shù)，分析了這些基因的組織表達(dá)譜；另外還通過(guò)分子克隆技術(shù)構(gòu)建真核和原核細(xì)胞表達(dá)載體，并通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染，實(shí)現(xiàn)目的基因的離體細(xì)胞超表達(dá)。研究結(jié)果證明： 1.梅山豬visfatin的2184 bp cDNA包含一個(gè)1473 bp全長(zhǎng)編碼區(qū)，同時(shí)還存在1958bp和1258 bp的visfatin差異剪接體(visf

3、atin variant 2和visfatin variant 3)；Variant 2由野生型visfatin (visfatin variant 1)發(fā)生226 bp的缺失所產(chǎn)生，Variant 3由野生型visfatin (visfatin variant 1)發(fā)生926 bp的缺失而形成；梅山豬visfatin序列所編碼的visfatin蛋白質(zhì)序列與人visfatin相比有95.5％的同源性。RT-PCR檢測(cè)表明梅山豬visfa

4、tin variant 1和variant 3在心、腦、肌肉、脂肪、胃、肺、睪丸、腸、腎和肝中均有表達(dá)，visfatin variant 2差異剪接體的表達(dá)在睪丸和肝中沒(méi)有檢測(cè)到。對(duì)人、大鼠和小鼠EST數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索和對(duì)小鼠來(lái)源的mRNA進(jìn)行的RT-PCR檢測(cè)表明，該差異剪接現(xiàn)象僅存在于豬中。 2.梅山豬omentin基因的1213 bp cDNA包含一個(gè)975 bp全長(zhǎng)omentin編碼區(qū)。梅山豬omentin序列所編碼的om

5、entin蛋白序列與人omentin有79.4％的同源性。RT-PCR檢測(cè)表明梅山豬omentin基因在腸和肌肉中表達(dá)。豬omentin基因由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，定位于豬染色體的4q15-q16區(qū)域。 3.梅山豬GNA14基因的1359 bp cDNA包含一個(gè)1068 bp編碼區(qū)。梅山豬GNA14編碼的GNA14蛋白序列與人GNA14有91.5％的同源性。RT-PCR檢測(cè)表明梅山豬GNA14在腎和肺中表達(dá)。GNA14定