解淀粉芽孢桿菌胞苷代謝途徑分析與高效基因敲除系統(tǒng)構(gòu)建的研究.pdf

1、胞苷，即胞嘧啶核苷，可用作功能性食品及核苷酸類保健食品的生產(chǎn)原料，也用于合成抗病毒和抗腫瘤藥物的中間體及飼料添加劑，用途廣泛，需求量逐年增加。微生物發(fā)酵法是工業(yè)生產(chǎn)胞苷的主要方法，高產(chǎn)菌株是其關(guān)鍵因素，已有枯草芽孢桿菌、大腸桿菌與解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)胞苷的研究報(bào)道。但目前國內(nèi)胞苷高產(chǎn)菌株的發(fā)酵能力有限，受到多種因素的影響，而菌株細(xì)胞自身合成代謝網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化是提高胞苷發(fā)酵產(chǎn)量必須要解決的問題。同時(shí)，為使解淀粉芽孢桿菌胞苷代謝網(wǎng)絡(luò)修飾更加快速

2、高效，需建立方便易操作的基因敲除系統(tǒng)。論文主要從以下兩個(gè)方面進(jìn)行了研究。
　　1、解淀粉芽孢桿菌胞苷合成代謝途徑分析。
　　(1)胞苷代謝網(wǎng)絡(luò)整體分析。基于嘧啶生物合成代謝調(diào)控和胞苷代謝網(wǎng)絡(luò)分析，提出了5種解淀粉芽孢桿菌胞苷生產(chǎn)菌育種策略，即提高嘧啶操縱子轉(zhuǎn)錄水平，強(qiáng)化胞苷合成代謝途徑、增大磷酸戊糖途徑向胞苷合成途徑的分流量、提高胞苷合成前端代謝物PRPP的合成量、增強(qiáng)中心碳代謝流向胞苷合成途徑和阻斷胞苷降解途徑等方法，選育

3、胞苷高產(chǎn)菌株。
　　(2)嘧啶操縱子在胞苷合成中的作用分析。確定首先改造解淀粉芽孢桿菌嘧啶操縱子調(diào)控區(qū)域，研究其對胞苷合成的影響。操縱子調(diào)控區(qū)存在一個(gè)弱化調(diào)節(jié)蛋白PyrR，由pyrR基因編碼。該調(diào)節(jié)蛋白通過作用于pyr操縱子非翻譯區(qū)域的三段轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)控制胞苷合成基因的表達(dá)與調(diào)控，但胞苷的過量合成與pyrR基因缺失影響尚不清楚。因此，可通過基因敲除技術(shù)，定向選育pyrR基因缺失菌株，研究其對解淀粉芽孢桿菌胞苷生物合成途徑的調(diào)控機(jī)制

4、。
　　2、解淀粉芽孢桿菌高效基因敲除系統(tǒng)的構(gòu)建。
　　為實(shí)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌胞苷代謝網(wǎng)絡(luò)的修飾改造，建立高效的基因敲除系統(tǒng)顯得尤為重要。本研究構(gòu)建了兩個(gè)基因敲除載體系統(tǒng)，并對其敲除效率做了比較分析。
　　(1)自殺型敲除載體pKS1-pyrR的構(gòu)建。以解淀粉芽孢桿菌基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)并合成含有限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的引物，利用PCR分別擴(kuò)增pyrR基因的上、游同源序列，定向克隆至含卡那霉素抗性基因的溫敏型載體pKS

5、1上，構(gòu)建自殺型敲除載體pKS1-pyrR，酶切、PCR驗(yàn)證與測序分析均證明pKS1-pyrR載體構(gòu)建正確。將pKS1-pyrR載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，通過同源重組將靶基因替換。結(jié)果表明，該方法重組敲除效率較低、且有抗性基因片段殘留，增加菌體負(fù)擔(dān)。
　　(2)CRISPR-Cas9基因敲除系統(tǒng)的構(gòu)建。首先構(gòu)建基因敲除載體系統(tǒng)pHT01-Cas9-donor。在解淀粉芽孢桿菌pyrR基因的45f和181r區(qū)通過PAM定位選擇合適的靶位點(diǎn)并

6、合成sg RNA。改造pHT01質(zhì)粒改造，構(gòu)建質(zhì)粒pHT01-Cas9。通過酶切酶連操作依次將RBS序列、RepA序列、p43啟動(dòng)子序列、sg RNA序列(45f/181r)和pyrR基因左右同源臂合并序列克隆至pHT01-Cas9載體中，酶切、PCR驗(yàn)證與測序分析均證明pHT01-Cas9-donor載體構(gòu)建正確。
　　(3)Cas9蛋白表達(dá)與pyrR基因誘導(dǎo)敲除。提取質(zhì)粒pHT01-Cas9-donor，轉(zhuǎn)化解淀粉芽孢桿菌，菌

7、落PCR及酶切驗(yàn)證均表明pHT01-Cas9-donor載體己成功轉(zhuǎn)化解淀粉芽孢桿菌。同時(shí)利用IPTG成功誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá)。優(yōu)化Cas蛋白表達(dá)條件，得出Cas9蛋白最優(yōu)誘導(dǎo)條件為誘導(dǎo)溫度30℃，IPTG濃度為0.6 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為6h。結(jié)果表明，pHT01-Cas9-donor敲除系統(tǒng)中各元件均能在解淀粉芽孢桿菌中很好的工作。但在最優(yōu)誘導(dǎo)條件下，嘗試敲除pyrR基因，均未成功，分析原因可能是設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)基因sgRNA未表現(xiàn)活

8、性。
　　(4)兩種敲除系統(tǒng)的應(yīng)用與比較分析。自殺型敲除載體系統(tǒng)和CRISPR-Cas9系統(tǒng)都可以對目標(biāo)基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯。自殺型敲除載體系統(tǒng)是傳統(tǒng)經(jīng)典方法，至今仍被廣泛應(yīng)用，但是對于解淀粉芽孢桿菌來說，其轉(zhuǎn)化效率與重組效率較低，且很難將重組到基因組上的抗性基因再替換下來，會(huì)給將來工程菌株的生產(chǎn)應(yīng)用帶來麻煩，因此，需要進(jìn)一步改進(jìn)該敲除系統(tǒng)或找到另一種更好的替代方法。而CRISPR-Cas9敲除系統(tǒng)具有可供選擇位點(diǎn)多、可同時(shí)編輯多個(gè)