大腸桿菌血紅素合成途徑的改造與調(diào)控對(duì)5-氨基乙酰丙酸積累和菌體代謝的影響.pdf

1、5-氨基乙酰丙酸(ALA)是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是生物體合成維生素B12、血紅素、葉綠素等四吡咯類化合物的前體物質(zhì)。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，ALA作為癌癥和腫瘤的診斷和治療的藥物引起了人們的廣泛關(guān)注;在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，ALA可用作選擇特異性高、可生物降解的除草劑、殺蟲(chóng)劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，具有重要的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。
　　目前ALA主要使用化學(xué)合成法進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，但化學(xué)合成的反應(yīng)步驟繁瑣、副產(chǎn)物多、分離提純復(fù)雜且得率低、環(huán)境污染嚴(yán)重。而生

2、物法合成ALA以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如操作方便、以廉價(jià)的可再生資源為底物、環(huán)境友好等而受到廣泛關(guān)注。ALA有兩種生物合成的方法:一條是依賴于C4途徑，添加琥珀酸和甘氨酸前體物，以類紅球菌或大腸桿菌為生產(chǎn)菌株的生物轉(zhuǎn)化法，該方法因需要添加琥珀酸和甘氨酸前體，價(jià)格比較昂貴，不適于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn);另一條是本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的以C5途徑為基礎(chǔ)，以廉價(jià)的葡萄糖為唯一碳源以大腸桿菌工程菌為生產(chǎn)菌株的發(fā)酵合成方法。但是目前該菌株的ALA產(chǎn)量仍然較低，需要進(jìn)一

3、步的探索研究限制其產(chǎn)量的因素，從而為得到具有高產(chǎn)量的ALA生產(chǎn)菌株打下基礎(chǔ)。
　　本研究首先利用多種代謝工程手段改造提高ALA產(chǎn)量，包括尋找更加有效的ALA分泌蛋白以進(jìn)一步促進(jìn)產(chǎn)物的分泌;敲除全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ArcA的編碼基因，解除雙組份系統(tǒng)ArcAB在微耗氧和厭氧條件下對(duì)TCA循環(huán)的抑制作用;探究發(fā)酵過(guò)程中溶氧條件對(duì)ALA產(chǎn)量的影響;過(guò)表達(dá)異源的來(lái)自嗜酸性亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans)的

4、谷氨酰tRNA合成酶（GluRS，由基因gltX1和gltX編碼）;過(guò)表達(dá)來(lái)自慢生根瘤菌（Bradyrhizobiumjaponicum）的HemB抑制因子Irr等。其中敲除arcA基因?qū)LA產(chǎn)量提高作用最為顯著，比對(duì)照積累量提高了43.59％。并且發(fā)現(xiàn)ALA的產(chǎn)量受溶氧水平影響，在發(fā)酵后期高的溶氧水平會(huì)引起編碼谷氨酰tRNA合成酶基因gltX表達(dá)的下調(diào)，過(guò)表達(dá)異源的來(lái)自嗜酸性亞鐵硫桿菌的谷氨酰tRNA合成酶基因能有效解除這種抑制作用

5、。
　　sRNARyhB參與大腸桿菌的鐵平衡調(diào)控，其在缺鐵環(huán)境下被激活，抑制一些含鐵蛋白的表達(dá)，從而減少鐵的消耗。我們進(jìn)一步組成型表達(dá)RyhB并分析了其對(duì)heme合成途徑的調(diào)控作用及對(duì)ALA產(chǎn)量的影響。在E.coliDALA中組成型表達(dá)ryhB，ALA的產(chǎn)量提高了16％，并且heme的積累顯著減少。同時(shí)，研究中發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加鐵離子會(huì)增加heme的積累并且減少ALA的產(chǎn)量，而向培養(yǎng)基中添加鐵離子螯合劑可減少heme的濃度并且增加

6、了ALA的生產(chǎn)效率（ALAyield/OD600）。qRT-PCR結(jié)果顯示除了已知的RyhB的目標(biāo)基因acnAB，sdhAB，fumA，cydAB的mRNA水平下降之外，hemB和hemH基因的表達(dá)也下調(diào)了。我們對(duì)RyhB序列與hemB和hemH的mRNA序列比對(duì)后分析，在hemB和hemH基因的mRNA內(nèi)部可能有RyhB的作用位點(diǎn)，由此猜測(cè)hemB和hemH是RyhB的目標(biāo)基因。盡管RyhB調(diào)節(jié)hemB和hemH的機(jī)理還沒(méi)有確定，至少

7、有三方面的原因引起了ALA產(chǎn)量的增加:第一，RyhB上調(diào)了ALA合成相關(guān)基因gltX的表達(dá);第二，RyhB下調(diào)了與ALA代謝有關(guān)基因的表達(dá);第三，heme積累量的減少解除了heme對(duì)ALA合成基因的反饋抑制作用。
　　有文獻(xiàn)報(bào)道heme合成過(guò)程偶聯(lián)能量的生成，本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)C5途徑基因?qū)Υ竽c桿菌呼吸代謝產(chǎn)生了影響。過(guò)表達(dá)C5途徑基因hemAM和hemL除了引起大腸桿菌ALA和heme的積累增加之外，還引起了乙酸、乳酸和琥珀酸積累

8、的明顯減少。為了深入分析產(chǎn)生這種實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的原因，我們利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌DAL的乙酸產(chǎn)生和清除基因、TCA循環(huán)整體基因表達(dá)均下調(diào)了，呼吸電子傳遞鏈的組成也由總H+/e-為4的NDH-1和Cyo組成的有氧呼吸鏈向總H+/e-為1的NDH-2和Cyd-I組成的產(chǎn)能效率較低的有氧呼吸鏈轉(zhuǎn)變。因此我們認(rèn)為加強(qiáng)C5途徑引起菌體中heme積累的增加，由于heme是大腸桿菌有氧呼吸鏈蛋白的輔基，heme一方面通過(guò)其本身參與呼吸作用影響大腸桿

9、菌的中心代謝，另一方面heme的合成過(guò)程偶聯(lián)呼吸電子傳遞鏈產(chǎn)生能量，從而影響大腸桿菌能量產(chǎn)生方式以及代謝流的分配，減少乙酸、乳酸等副產(chǎn)物的產(chǎn)生，提高了碳源的利用效率。
　　綜上所述，本論文在本實(shí)驗(yàn)室首次構(gòu)建的以C5途徑合成ALA的大腸桿菌工程菌的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)敲除和外源表達(dá)傳統(tǒng)代謝工程的多種手段，結(jié)合組成型表達(dá)小RNARyhB的新策略，多方面提高工程菌的ALA產(chǎn)量。并且通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)手段，分析過(guò)量表達(dá)C5途徑基因?qū)Υ竽c桿菌呼吸代