納米級(jí)炭黑顆粒對(duì)16HBE細(xì)胞毒性作用及影響因素的研究.pdf

1、目的:炭黑（carbon black,CB）是一種超細(xì)碳粒子，是燃料不完全燃燒時(shí)產(chǎn)生的煙塵中的主要組成部分。炭黑納米顆粒（carbon black nanoparticles,CBNPs）是通過(guò)控制碳?xì)浠衔锏臍庀嗔呀膺^(guò)程生產(chǎn)制造而成的純的炭黑粉末，隨著CBNPs的商業(yè)化及CB向大氣的排放量持續(xù)升高，CBNPs的暴露與人類(lèi)健康風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估備受關(guān)注。有研究證明處于不同周期的細(xì)胞會(huì)對(duì)納米顆粒的攝取量存在差異，而細(xì)胞內(nèi)納米顆粒的含量與其所引起的

2、細(xì)胞毒性密切相關(guān)。目前CBNPs對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性損害以及不同細(xì)胞周期對(duì)于細(xì)胞的CBNPs攝取量是否產(chǎn)生影響尚不清楚，因此探究CBNPs產(chǎn)生的細(xì)胞損傷作用及不同周期對(duì)細(xì)胞攝取CBNPs量的影響具有十分重要的意義。本研究通過(guò)研究不同細(xì)胞周期對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE）的CBNPs攝取量的影響為切入點(diǎn)，探究CBNPs對(duì)16HBE的細(xì)胞毒性效應(yīng)及其影響因素。
　　方法：
　　1.納米炭黑顆粒表征觀察
　　通過(guò)掃描電子顯微鏡

3、和透射電子顯微鏡觀察納米炭黑的結(jié)構(gòu)特征。采用粒徑分析儀分析納米炭黑的粒徑，BET比表面積測(cè)試法測(cè)量炭黑顆粒比表面積。
　　2.細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞模型建立
　　16HBE（中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）用含10％熱滅活胎牛血清的MEM培養(yǎng)基37℃，5%CO2飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用CBNPs處理24小時(shí)，劑量分別為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL；以MEM（含0.04%Tween80）為陰性對(duì)照。<

4、br>　　3.MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率
　　分別使用陰性對(duì)照組和1、10、50、100、200、300μg/mL CBNPs染毒組處理16HBE細(xì)胞3、6、12、24、36h。加入MTT孵育后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在495nm波長(zhǎng)處的吸光度值。每組設(shè)置六個(gè)復(fù)孔，計(jì)算各組吸光度并統(tǒng)計(jì)各染毒組細(xì)胞存活率。
　　4.細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的測(cè)定
　　將CBNPs染毒處理后的細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，用2,7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（2,7-

5、dichlorodihydrf-luorescein diacetate,DCFH-DA）熒光探針進(jìn)行孵育，流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同劑量CBNPs處理后16HBE細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species,ROS）的含量；16HBE細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性以及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（ma

6、lonaldehyde， MDA）含量采用生化試劑盒并按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行定量檢測(cè)。
　　5.細(xì)胞DNA損傷的測(cè)定
　　應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳（single cell gel ectrophoresis，SCGE）實(shí)驗(yàn)，通過(guò)觀測(cè)染毒前后Olive尾踞的變化，檢測(cè)CBNPs對(duì)細(xì)胞DNA的損傷。
　　6.AnnexinⅤ-PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　染毒24小時(shí)后將陰性對(duì)照和各染毒組細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，采用AnnexinⅤ-F

7、ITC和PI雙染標(biāo)記，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　7.細(xì)胞周期檢測(cè)
　　將陰性對(duì)照和各染毒組制備成單細(xì)胞懸液，用-20℃預(yù)冷的80%的乙醇固定后，先后使用RNAseA和PI處理細(xì)胞，之后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行周期檢測(cè)。
　　8.細(xì)胞周期的同步化
　　使用害羞草堿使16HBE細(xì)胞同步于G0/G1期，胸苷雙阻斷法使16HBE細(xì)胞同步于S期，諾考達(dá)唑使細(xì)胞同步于G2/M期。
　　9.細(xì)胞攝取CBNPs檢測(cè)

8、>　　將陰性對(duì)照和各染毒組16HBE細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)PBS洗滌兩次后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò) SSC密度含量的改變來(lái)定量分析16HBE對(duì) CBNPs的攝取量。另外采用ImageStreamX單細(xì)胞成像流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組樣本并獲取各劑量組細(xì)胞的明場(chǎng)及暗場(chǎng)圖像和數(shù)據(jù)，由此分析16HBE攝取CBNPs的情況。
　　結(jié)果：
　　1.納米炭黑顆粒表征
　　電子顯微鏡下觀察，納米炭黑為球狀顆粒。透射電鏡顯示炭黑顆粒

9、大體呈葡萄球狀，分散良好，顆粒直徑在30~50nm之間。掃描電鏡顯示炭黑顆粒近似呈球形，分散較均勻，團(tuán)聚顆粒直徑大約200~400nm之間。較大顆粒表面有很多球形突出物。利用 BET比表面積測(cè)試法測(cè)量炭黑顆粒比表面積為74.85m2/g。炭黑顆粒難溶于水，在水溶劑中炭黑團(tuán)聚顆粒直徑為200~400nm，而在0.04%Tween80中有較好的分散性，顆粒直徑為30~50nm。
　　2.CBNPs對(duì)16HBE細(xì)胞活性的影響
　　

10、當(dāng)用100、200和300μg/mL CBNPs處理16HBE細(xì)胞3h后，各劑量組細(xì)胞存活率逐漸降低（P<0.05）；當(dāng)用50、100、200和300μg/mL CBNPs處理16HBE細(xì)胞6h后，各劑量組細(xì)胞存活率逐漸降低（P<0.05）；當(dāng)用1、10、50、100、200和300μg/mL CBNPs處理細(xì)胞12、24、36h后，各劑量組細(xì)胞存活率逐漸降低（P<0.05）；隨著染毒濃度和時(shí)間的增加，16HBE細(xì)胞活性降低更加明顯。這

11、些結(jié)果表明CBNPs抑制16HBE細(xì)胞存活并且這種抑制效應(yīng)存在劑量和時(shí)間依賴性。
　　3.CBNPs誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞凋亡
　　用50、100和200μg/mL的CBNPs處理16HBE細(xì)胞24小時(shí)。發(fā)現(xiàn)50μg/mL和100μg/mL CBNPs處理的16HBE早期凋亡細(xì)胞數(shù)目略微升高（P>0.05）；200μg/mL CBNPs處理可誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞早期凋亡率顯著增加（P<0.05）；隨著CBNPs染毒濃度增加，晚期凋

12、亡細(xì)胞所占的百分率和細(xì)胞壞死細(xì)胞的百分率逐漸升高（P<0.05）。這些結(jié)果表明CBNPs對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用至少可以部分解釋為CBNPs誘導(dǎo)的凋亡和壞死。
　　4.CBNPs對(duì)16HBE細(xì)胞氧化損傷的測(cè)定
　　不同濃度CBNPs處理16HBE細(xì)胞24小時(shí)后，隨著染毒濃度的增加， ROS水平逐漸升高（P<0.05）；MDA含量逐漸增加（P<0.05）；SOD和GSH-Px活力隨CBNPs染毒濃度的增加而逐漸降低（P<0.05）

13、。說(shuō)明CBNPs可以誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞氧化損傷。
　　5.CBNPs對(duì)16HBE細(xì)胞DNA損傷的誘導(dǎo)作用
　　不同劑量的CBNPs處理16HBE細(xì)胞24小時(shí)后，隨著染毒濃度的增加，各劑量組Olive尾距顯著增加，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說(shuō)明CBNPs可以誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞DNA損傷。
　　6.CBNPs對(duì)16HBE細(xì)胞周期的影響
　　用100μg/mL CBNPs對(duì)16HBE細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)

14、處理，發(fā)現(xiàn)CBNPs誘導(dǎo)S期和 G2/M期細(xì)胞比率增加（P<0.05）。S期細(xì)胞比率增加發(fā)生在6至24小時(shí); G2/M期細(xì)胞比率增加發(fā)生在18至36小時(shí)。說(shuō)明CBNPs誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞周期阻滯，且阻滯發(fā)生于S期和G2/M期。
　　7.16HBE細(xì)胞對(duì)CBNPs的攝取
　　用50、100和200μg/mL的CBNPs處理16HBE細(xì)胞24小時(shí)，采用流式細(xì)胞儀和 ImageStreamX成像流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)CBN

15、Ps量逐漸升高（P<0.05）；將16HBE細(xì)胞分別同步化于G0/G1期，S期和G2/M期并進(jìn)行CBNPs染毒處理。經(jīng)6小時(shí)和24小時(shí)染毒后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)觀察到同步于S期和G2/M期的16HBE細(xì)胞比同步于G0/G1期的16HBE細(xì)胞有更高的CBNPs攝取量，其中同步于G2/M期的16HBE細(xì)胞對(duì)CBNPs攝取量最高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明不同細(xì)胞周期階段可以影響16HBE細(xì)胞對(duì)CBNPs的攝取效果。