納米金棒對(duì)A549細(xì)胞毒性的機(jī)制研究.pdf

1、納米金棒(Gold nanorods，AuNRs)是指尺度介于1-100nm之間的棒狀納米金顆粒，在光學(xué)特性、量子隧道效應(yīng)、生物相容性、表面易修飾性和穩(wěn)定性等方面具有獨(dú)特的物理及化學(xué)屬性，因此被認(rèn)為是最具應(yīng)用前景的納米材料之一。近年來，隨著納米技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，AuNRs在細(xì)胞和動(dòng)物活體成像、藥物和基因傳遞以及多種疾病的診斷和治療等方面的運(yùn)用越來越多。然而，隨著AuNRs廣泛應(yīng)用，人們接觸AuNRs的機(jī)會(huì)日益增多，AuNRs暴露

2、所引起的生物安全問題也受到越來越多的關(guān)注。因此，探究AuNRs對(duì)生物體可能潛在的影響及其機(jī)制是納米金材料得到更加安全、廣泛運(yùn)用的基礎(chǔ)。
　　本研究擬首先采用不同濃度AuNRs處理A549細(xì)胞6h、12h和24h，然后通過CCK-8、LDH實(shí)驗(yàn)觀察AuNRs對(duì)A549細(xì)胞活力、細(xì)胞膜損傷的影響。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用透射電鏡觀察AuNRs對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，并初步判斷AuNRs的細(xì)胞毒性。進(jìn)一步，擬運(yùn)用Western blot技術(shù)、激光

3、掃描共聚焦顯微技術(shù)和其他分子生物學(xué)方法來觀察AuNRs細(xì)胞毒性是否與其通過損傷線粒體相關(guān)功能、促進(jìn)氧化應(yīng)激進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有關(guān)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　一、AuNRs對(duì)A549細(xì)胞毒性的影響
　　首先，將正常培養(yǎng)的A549細(xì)胞給予不同濃度AuNRs處理（0μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml），分別處理6h、12h、24h后觀察其對(duì)細(xì)胞活力、細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:

4、r>　　1.AuNRs對(duì)A549細(xì)胞活力的影響
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用不同濃度AuNRs處理后，A549細(xì)胞活力呈劑量、時(shí)間依賴性降低。提示，AuNRs細(xì)胞毒性呈劑量、時(shí)間依賴性增加。
　　2.AuNRs對(duì)A549細(xì)胞膜損傷的影響
　　LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用不同濃度AuNRs處理后，A549細(xì)胞呈現(xiàn)LDH滲漏且上清LDH呈劑量、時(shí)間依賴性增加。提示，AuNRs細(xì)胞毒性呈劑量、時(shí)間依賴性增加，AuNRs作用的

5、濃度越高、時(shí)間越長，對(duì)細(xì)胞的毒性越大。
　　3.AuNRs對(duì)A549細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響
　　透射電鏡研究結(jié)果表明，AuNRs能夠進(jìn)入A549細(xì)胞，并以單個(gè)顆?；蚓奂w的形式存在于細(xì)胞質(zhì)和部分膜囊泡中，而細(xì)胞核未觀察到AuNRs。此外，細(xì)胞中部分線粒體呈不同程度腫脹，并且自噬小體數(shù)目較對(duì)照組顯著增加。
　　二、AuNRs對(duì)A549細(xì)胞自噬的影響
　　研究發(fā)現(xiàn)，自噬是納米材料細(xì)胞毒性的重要機(jī)制之一。那么AuNRs對(duì)A

6、549細(xì)胞毒性是否與自噬有關(guān)呢？我們進(jìn)行以下研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.AuNRs對(duì)A549細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3的影響
　　激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明，不同濃度AuNRs處理A549細(xì)胞6h后，LC3表達(dá)呈劑量依賴性增加。其中，Con組LC3主要表達(dá)并集中于細(xì)胞核，而隨著AuNRs濃度的增加，LC3表達(dá)逐漸從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核LC3表達(dá)逐步減少并呈空泡化。
　　再將A549細(xì)胞給予2μg/ml的AuN

7、Rs分別處理6h、12h和24h并觀察LC3表達(dá)情況，結(jié)果表明，A549細(xì)胞LC3表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加。Con組LC3主要表達(dá)并集中于細(xì)胞核，而隨著AuNRs暴露時(shí)間的增加，LC3表達(dá)逐漸從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核LC3表達(dá)逐步減少并呈空泡化。
　　2.AuNRs對(duì)A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響
　　Western blot結(jié)果表明，不同濃度AuNRs處理A549細(xì)胞6h后，LC3-Ⅱ、ATG4、ATG16和Beclin1

8、蛋白表達(dá)顯著增加，而自噬底物蛋白P62表達(dá)水平顯著降低。提示，AuNRs誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生自噬呈劑量、時(shí)間依賴性增加。
　　3.CQ能夠抑制AuNRs誘導(dǎo)的自噬
　　Western blot結(jié)果表明，正常培養(yǎng)條件下Con組ATG16、LC3-Ⅱ少量表達(dá)，給予CQ處理后ATG16、LC3-Ⅱ表達(dá)較Con組顯著增加，表明CQ可以抑制基礎(chǔ)水平自噬溶酶體降解。給予AuNRs處理后，ATG16、LC-Ⅱ表達(dá)較對(duì)照組顯著增加。AuNR

9、s和CQ共同處理A549細(xì)胞6h后，ATG16高表達(dá)可被CQ逆轉(zhuǎn)，而LC3-Ⅱ表達(dá)則進(jìn)一步增加。這一結(jié)果表明，CQ不僅可以抑制由AuNRs誘導(dǎo)自噬的起始，而且可以抑制自噬溶酶體降解。
　　三、氧化應(yīng)激介導(dǎo)AuNRs誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生的自噬
　　近年來有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的重要原因。那么AuNRs誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生自噬是否與氧化應(yīng)激有關(guān)？我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.抗氧化劑MnTBAP和NAC能夠抑制

10、AuNRs誘導(dǎo)的自噬
　　Western blot結(jié)果表明，Con組中LC3-Ⅱ表達(dá)水平較低，MnTBAP、NAC處理后其表達(dá)水平輕微降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而AuNRs處理6h后，LC3-Ⅱ表達(dá)顯著增加，并且這一效應(yīng)能被MnTBAP、NAC所逆轉(zhuǎn)。提示，MnTBAP、NAC可以改善AuNRs誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生的自噬。
　　激光掃描共聚焦顯微鏡研究表明，Con組、NAC組中LC3表達(dá)較弱且主要集中于細(xì)胞核，表明其自噬水平很低。

11、而AuNRs處理6h后，LC3蛋白質(zhì)從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核LC3表達(dá)逐步減少并呈空泡化。而抗氧化劑NAC能夠逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)。
　　2.抗氧化劑MnTBAP和NAC能夠逆轉(zhuǎn)AuNRs誘導(dǎo)的ROS增加
　　激光掃描共焦顯微鏡研究表明，不同濃度AuNRs處理A549細(xì)胞6h后，Con組未觀察到ROS陽性細(xì)胞，表明其ROS水平很低。而隨著AuNRs濃度的增加，陽性ROS細(xì)胞數(shù)量和綠色熒光亮度明顯增加且呈劑量依賴性，表明AuNRs

12、能夠誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，濃度越高，ROS水平越高。而抗氧化劑MnTBAP、NAC能夠逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)。
　　3.抗氧化劑MnTBAP和NAC能夠改善AuNRs誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)
　　T-AOC、GSH/GSSG檢測(cè)結(jié)果表明，AuNRs處理組T-AOC、GSH/GSSG較Con組顯著降低，表明AuNRs處理后細(xì)胞抗氧化能力顯著降低，而MnTBAP、NAC處理6h后能夠逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)。
　　4.抗氧化劑NAC能夠逆轉(zhuǎn)AuNRs誘導(dǎo)

13、線粒體功能的降低
　　線粒體膜電位和ATP含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AuNRs處理后其線粒體膜電位和ATP含量較Con組顯著降低，表明AuNRs處理細(xì)胞后其線粒體功能降低，而NAC處理6h后能夠逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)。Western blot結(jié)果表明，AuNRs處理組UCP2表達(dá)顯著降低。NAC處理6h后UCP2蛋白表達(dá)顯著增加，提示UCP2蛋白表達(dá)降低與線粒體功能改變有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.AuNRs能夠進(jìn)入A549細(xì)胞，引起

14、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。AuNRs具有一定的細(xì)胞毒性且呈劑量、時(shí)間依賴性增加，AuNRs濃度越高、作用時(shí)間越長，細(xì)胞毒性越大。
　　2.AuNRs能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生自噬并能被自噬抑制劑CQ所抑制，自噬標(biāo)志蛋白LC3、自噬相關(guān)蛋白ATG16、ATG4、Beclin-1表達(dá)增加，而自噬底物蛋白P62表達(dá)降低且呈劑量依賴性。
　　3.AuNRs能夠影響A549細(xì)胞線粒體相關(guān)功能，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力降低、ROS水平增加，后者