MNNG誘導(dǎo)hTR基因沉默的16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型建立的研究.pdf

1、目的：在于應(yīng)用RNAi技術(shù)建立hTR基因缺陷的16HBE細(xì)胞株，嘗試用人工誘變方法誘導(dǎo)該細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，建立hTR基因缺陷的人類細(xì)胞體外腫瘤發(fā)生模型，為研究人類腫瘤發(fā)生中hTR基因的功能及相關(guān)作用分子的篩選提供平臺(tái)。 方法：⑴在pUC119-U6載體U6啟動(dòng)子下游插入干擾序列獲得pUC119-U6-shRNA1、2表達(dá)體。⑵將兩個(gè)pUC119-U6-shRNA1、2表達(dá)體中U6-shRNA1、2分別克隆入pEGFP—C1中，獲

2、得帶有抗生素標(biāo)記和便于觀察的綠色熒光蛋白基因的重組質(zhì)粒pEGFP—U6-shRNA1、2。⑶將重組質(zhì)粒pEGFP—U6-shRNA1，2及空載體pEGFP—C1分別經(jīng)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞72小時(shí)后，提取各組細(xì)胞的總RNA，用RT—PCR檢測(cè)hTR基因的沉默水平。⑷將有效干擾作用的重組表達(dá)體pEGFP—U6-shRNA1及空載體pEGFP—C1分別經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞，經(jīng)藥物G418加壓篩選及綠色熒光挑選后，獲得兩株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

3、的細(xì)胞株，稱16HBE-1，16HBE—C1。⑸提取各組細(xì)胞總RNA，用RT—PCR檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株中hTR基因的沉默水平。⑹MTT法繪制生長(zhǎng)曲線以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化。⑺通過絕對(duì)克隆形成率和相對(duì)克隆形成率確定MNNG的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)濃度。⑻MNNG分別隔代染毒16HBE、16HBE—C1和16HBE-1至27代。⑼細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察、生長(zhǎng)曲線測(cè)定、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)初步鑒定細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。 結(jié)果：①測(cè)序證實(shí)pUC119-U6-

4、shRNA1、2表達(dá)體堿基序列無(wú)誤；②測(cè)序證實(shí)改造后重組質(zhì)粒pEGFP—U6-shRNA1、2堿基序列無(wú)誤；③轉(zhuǎn)染各質(zhì)粒的16HBE細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pEGFP—U6-shRNA1組hTR的mRNA表達(dá)明顯降低；而pEGFP—U6-shRNA2組hTR的mRNA表達(dá)降低無(wú)明顯變化，該組將不再進(jìn)行穩(wěn)定克隆株的篩選；④成功獲得16HBE-1和16HBE—C1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株；⑤16HBE-1細(xì)胞株中hTR的mRNA表達(dá)較16HBE和16HBE—C1

5、細(xì)胞明顯降低，16HBE—C1細(xì)胞株中hTR的mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化；⑥16HBE-1細(xì)胞生長(zhǎng)速度較16HBE和16HBE—C1細(xì)胞生長(zhǎng)顯著減慢；16HBE-1與16HBE和16HBE—C1相比，其細(xì)胞周期均有明顯改變；⑦確定1ug/ml作為有效轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的劑量；⑧連續(xù)染毒至第27次的16HBE-1細(xì)胞中首先出現(xiàn)“轉(zhuǎn)化灶”；⑨分離轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)后的細(xì)胞獲得以下特性：細(xì)胞呈密集單層并堆積、生長(zhǎng)速度加快、能在軟瓊脂中生長(zhǎng)等。 結(jié)