GSTM5對TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞炎癥水平的影響及其機制的探討.pdf

1、急性肺損傷（acute lung injury，ALI）因其高發(fā)病率、高病死率一直是人們關(guān)注的熱點。但目前為止，ALI的發(fā)病機制仍不是很清楚，普遍認(rèn)為促炎因子與抗炎因子失衡導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)失控是ALI的本質(zhì)。因此，控制ALI時炎癥因子釋放、減輕ALI時炎癥反應(yīng)是治療ALI的關(guān)鍵。我們前期研究ALI與氧化應(yīng)激關(guān)系中發(fā)現(xiàn)， ALI時活性氧生成增加，同時谷胱甘肽硫-轉(zhuǎn)移酶 mu5（Glutathione S-transferase mu5, G

2、STM5）表達(dá)也增加，并從細(xì)胞漿進(jìn)入細(xì)胞核與氧化應(yīng)激相關(guān)基因結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。為此，我們推測 GSTM5也參與ALI時炎癥反應(yīng)調(diào)控，設(shè)計實驗通過ELISA、RT-PCR、Western Blot等方法探討GSTM5與ALI炎癥因子的關(guān)系及其作用機制，為ALI靶點治療提供新方向。
　　目的:
　　探討GSTM5對TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞炎癥水平的影響；探索GSTM5對TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞炎癥水平調(diào)控的分子

3、機制。
　　方法:
　　3.1 GSTM5對TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞炎癥水平的影響
　　3.1.1構(gòu)建GSTM5-GFP真核表達(dá)載體
　　標(biāo)記綠色熒光蛋白的GSTM5-GFP融合質(zhì)粒由Invitrogen公司合成，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光即證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　3.1.2建立急性肺損傷細(xì)胞炎癥模型
　　腫瘤壞死因子-α（TNF-α；10ng/ml）刺激16HBE細(xì)胞。

4、　　3.1.3 ELISA檢測細(xì)胞上清中IL-6、IL-8、IL-10表達(dá)水平
　　實驗分組：空白對照組（不加干預(yù)因素）、TNF-α組（僅用 TNF-α刺激）、GSTM5組（預(yù)轉(zhuǎn)染GSTM5質(zhì)粒且用TNF-α刺激）、陰性對照組（預(yù)轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒且用TNF-α刺激）。
　　嚴(yán)格按照ELISA說明書的實驗步驟及實驗條件逐步操作，分別檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8、IL-10濃度，重復(fù)檢測4次，結(jié)果取平均值。

5、　　3.2 GSTM5對TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞炎癥水平調(diào)控的分子機制
　　3.2.1GSTM5對TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞總NF-κB/p65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測細(xì)胞分組及干預(yù)因素同上。RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳法檢測NF-κB/p65 mRNA表達(dá)水平，重復(fù)檢測4次，結(jié)果取平均值。
　　3.2.2GSTM5對TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞NF-κB/p65、p38磷酸化水平的檢測
　　細(xì)胞分組及干預(yù)

6、因素同上。Western Blot檢測NF-κB/p65、P-NF-κB/p65、p38、P-p38表達(dá)水平，重復(fù)檢測4次，取平均值。
　　3.3統(tǒng)計學(xué)方法
　　實驗結(jié)果采用SPSS22統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示。比較各組間的差異均采用單因素方差分析，首先進(jìn)行總體組間差異和方差齊性檢驗，總體有差異后再進(jìn)行組間多重比較，方差齊用LSD，方差不齊用Dunnett檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)

7、意義。
　　結(jié)果:
　　4.1 GSTM5對TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞炎癥水平的影響
　　4.1.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，證實成功構(gòu)建GSTM5-GFP真核表達(dá)質(zhì)粒且轉(zhuǎn)染成功。
　　4.1.2TNF-α誘導(dǎo)后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8、IL-10濃度較空白對照組升高（P＜0.05），而GSTM5組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、IL-10均較TNF-α組降低（P＜0.05），差

8、異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.2 GSTM5對TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞炎癥水平調(diào)控的分子機制
　　4.2.1給予TNF-α刺激后，GSTM5組、TNF-α組和陰性對照組細(xì)胞總NF-κB/p65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均較空白對照組明顯升高（P＜0.05），而GSTM5組較TNF-α組、陰性對照組降低（P＜0.05）。
　　4.2.2給予TNF-α刺激后，GSTM5組、TNF-α組和陰性對照組細(xì)胞NF-κB/p65、p38磷