南極中山站沉積物宏基因組文庫的構建及堿性蛋白酶基因ACPRO001的克隆、表達和性質分析.pdf

1、本文從南極中山站排污入?？?ZSS)沉積物樣品中直接提取環(huán)境樣品微生物總DNA，大小在48Kb以上。經(jīng)過吹打調整DNA片段大小(到30-45Kb)后構建了ZS cosmid宏基因組文庫，獲得了約6500個陽性克隆子。推算該DNA文庫的總容量為228Mb，可以覆蓋約10株類似E.coli菌株的總基因組。 采用蛋白酶活性篩選功能板篩選該文庫我們得到了一個編號為1146的陽性克隆能夠分解底物脫脂牛奶，在篩選平板上產(chǎn)生清晰的透明水解圈

2、。DNA測序后分析表明該克隆外源DNA包含一個由425個氨基酸編碼組成的蛋白質的完整的開放閱讀框(ORF)，GC含量為50.6％。BLAST軟件分析該外源DNA包含一個完整的堿性蛋白酶基因，預測該蛋白質的分子量Mw為44.833kD。PCR擴增了蛋白酶基因的DNA序列并連接到大腸桿菌表達載體pET-His上，在大腸桿菌BL21(DE3)中實現(xiàn)了表達，并對該酶的生化特性進行了研究。酶學數(shù)據(jù)表明克隆1146所產(chǎn)堿性蛋白酶最適作用pH值為9.