宏基因組文庫(kù)中芳香聚酮合酶基因簇的篩選與表達(dá).pdf

1、環(huán)境中微生物資源的多樣性，決定了其代謝產(chǎn)物生物活性的多樣性。從可培養(yǎng)的環(huán)境微生物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了四環(huán)素，氯霉素，利福霉素等。隨著這種傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法的繼續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)找到的化合物的重復(fù)率高達(dá)99％，新結(jié)構(gòu)化合物的獲得越來越困難。研究表明，只有少于1％的微生物可在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室條件下分離培養(yǎng)。而絕大多數(shù)的微生物不能用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法培養(yǎng)。
　　宏基因組學(xué)技術(shù)是一種不依賴于微生物培養(yǎng)的技術(shù)，直接從環(huán)境樣品中提取微生物全部遺傳物質(zhì)，對(duì)DN

2、A末端修復(fù)、與合適的載體連接，轉(zhuǎn)化到宿主菌中建立宏基因組文庫(kù)。然后對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選與分析，得到新的基因或生物活性產(chǎn)物。突破了微生物的培養(yǎng)瓶頸，是極具潛力的新方法。
　　具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤等多種生物活性的芳香聚酮化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的作用。隨著耐藥菌的出現(xiàn)和治療疾病的需要，新型芳香聚酮的發(fā)現(xiàn)非常迫切。但是由于絕大多數(shù)微生物不能在現(xiàn)有條件下培養(yǎng)，使芳香聚酮的發(fā)現(xiàn)受到極大的限制。不依賴微生物培養(yǎng)性的宏基因組學(xué)方法，直接克隆芳香聚

3、酮的生物合成基因簇，使其在容易培養(yǎng)的宿主中異源表達(dá)，這為藥物開發(fā)提供了方便。
　　本課題利用構(gòu)建的珠穆朗瑪峰土壤宏基因組文庫(kù)，篩選獲得含有芳香聚酮同源基因KSα的陽性克隆。并對(duì)含有完整芳香聚酮合酶基因簇的陽性克隆轉(zhuǎn)化子在白色鏈霉菌中異源表達(dá)。
　　首先根據(jù)芳香聚酮合酶基因中同源基因KSα設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用PCR擴(kuò)增的方法，對(duì)珠穆朗瑪峰土壤宏基因組文庫(kù)中的質(zhì)粒進(jìn)行初步篩選。再根據(jù)簡(jiǎn)并引物篩選得到的序列與NCBI上已知的序列比對(duì)

4、，對(duì)其結(jié)果正確的序列設(shè)計(jì)特異性引物，篩選文庫(kù)菌液，最終得到26個(gè)含有芳香聚酮合酶同源基因KSα的單克隆。經(jīng)過對(duì)單克隆的末端測(cè)序，對(duì)含有不完整聚酮合酶基因簇的單克隆根據(jù)末端序列再次設(shè)計(jì)引物，篩選獲得重疊克隆。
　　對(duì)含有完整聚酮合酶基因簇的陽性克隆轉(zhuǎn)化子在白色鏈霉菌中異源表達(dá)。其中493編號(hào)陽性克隆轉(zhuǎn)化子在白色鏈霉菌中異源表達(dá)，得到的發(fā)酵液經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有特異性峰。并對(duì)一金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌有抑制其生長(zhǎng)的作用。