宏基因組文庫中芳香聚酮合酶基因簇的篩選與表達.pdf

1、環(huán)境中微生物資源的多樣性，決定了其代謝產物生物活性的多樣性。從可培養(yǎng)的環(huán)境微生物中已經發(fā)現(xiàn)了四環(huán)素，氯霉素，利福霉素等。隨著這種傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法的繼續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)找到的化合物的重復率高達99％，新結構化合物的獲得越來越困難。研究表明，只有少于1％的微生物可在現(xiàn)有的實驗室條件下分離培養(yǎng)。而絕大多數的微生物不能用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法培養(yǎng)。
　　宏基因組學技術是一種不依賴于微生物培養(yǎng)的技術，直接從環(huán)境樣品中提取微生物全部遺傳物質，對DN

2、A末端修復、與合適的載體連接，轉化到宿主菌中建立宏基因組文庫。然后對文庫進行篩選與分析，得到新的基因或生物活性產物。突破了微生物的培養(yǎng)瓶頸，是極具潛力的新方法。
　　具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤等多種生物活性的芳香聚酮化合物在醫(yī)藥領域有著廣泛的作用。隨著耐藥菌的出現(xiàn)和治療疾病的需要，新型芳香聚酮的發(fā)現(xiàn)非常迫切。但是由于絕大多數微生物不能在現(xiàn)有條件下培養(yǎng)，使芳香聚酮的發(fā)現(xiàn)受到極大的限制。不依賴微生物培養(yǎng)性的宏基因組學方法，直接克隆芳香聚

3、酮的生物合成基因簇，使其在容易培養(yǎng)的宿主中異源表達，這為藥物開發(fā)提供了方便。
　　本課題利用構建的珠穆朗瑪峰土壤宏基因組文庫，篩選獲得含有芳香聚酮同源基因KSα的陽性克隆。并對含有完整芳香聚酮合酶基因簇的陽性克隆轉化子在白色鏈霉菌中異源表達。
　　首先根據芳香聚酮合酶基因中同源基因KSα設計簡并引物，利用PCR擴增的方法，對珠穆朗瑪峰土壤宏基因組文庫中的質粒進行初步篩選。再根據簡并引物篩選得到的序列與NCBI上已知的序列比對

4、，對其結果正確的序列設計特異性引物，篩選文庫菌液，最終得到26個含有芳香聚酮合酶同源基因KSα的單克隆。經過對單克隆的末端測序，對含有不完整聚酮合酶基因簇的單克隆根據末端序列再次設計引物，篩選獲得重疊克隆。
　　對含有完整聚酮合酶基因簇的陽性克隆轉化子在白色鏈霉菌中異源表達。其中493編號陽性克隆轉化子在白色鏈霉菌中異源表達，得到的發(fā)酵液經高效液相色譜檢測發(fā)現(xiàn)有特異性峰。并對一金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌有抑制其生長的作用。