山羊瘤胃宏基因組文庫蛋白酶的篩選分離.pdf

1、瘤胃是反芻動物的一個重要消化器官，其中含有豐富的微生物資源，主要包括細菌、真菌、原生動物等多種微生物，約90％左右為未培養(yǎng)微生物。瘤胃中蛋白質的降解提供了反芻動物40％的氮源，因此瘤胃具有復雜的蛋白酶系，以完成蛋白質的降解。與多糖降解酶相比，瘤胃中蛋白質降解酶類的研究相對較少，是一個有待挖掘的良好資源。因此，本研究利用宏基因組技術，從山羊瘤胃中篩選具有新穎特性的蛋白酶類。
　　 實驗室前期構建了山羊瘤胃宏基因組文庫。本論文利用功

2、能驅動篩選策略，以脫脂牛奶作底物篩選文庫，獲得了兩個陽性克隆:R-P-1和R-P-2。以酪蛋白為底物的SDS-PAGE蛋白酶譜分析，發(fā)現(xiàn)R-P-1能產生1條蛋白酶活性帶，R-P-2則能產生3條蛋白酶降解帶。對陽性克隆插入序列進行末端測序分析發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與GenBank的已有序列一致性較低，顯示其新穎性。對R-P-1和R-P-2進行全序列測序。經注釋，在R-P-1上發(fā)現(xiàn)了1個絲氨酸蛋白酶編碼基因(1SP1)，在R-P-2上發(fā)現(xiàn)了4個絲

3、氨酸蛋白酶編碼基因(2SP1-2SP4)和1個肽酶編碼基因(2P)。另外這些蛋白質序列與數(shù)據(jù)庫中已知序列相比，同源性較低。經過構建蛋白質進化樹分析，發(fā)現(xiàn)各蛋白酶與同家族的已知蛋白酶進化關系較遠，獨立成分支，進一步說明各蛋白酶的新穎性。蛋白酶組分的亞細胞定位預測顯示各蛋白酶大都定位在胞外或細胞外膜，這些有利于它們對胞外蛋白質分子進行降解。R-P-2上4個絲氨酸蛋白酶基因，其編碼的蛋白酶都屬于Peptidase_S8家族，然而在序列上又存在

4、著一定的差異，推測其功能上具有一定互補性，以協(xié)同高效地完成胞外復雜蛋白質的降解。
　　 以陽性克隆R-P-2的培養(yǎng)液制備粗酶樣品，測定顯示其中的蛋白酶具有較廣的pH耐受范圍。粗酶液經60％飽和硫酸銨沉淀、Q-XL柱離子交換層析和Superdex7510/300GL柱分子篩層析后，SDS-PAGE檢測顯示初步分離到兩個具有蛋白酶活性的組分RP2a和RP2b，LC-MS/MS鑒定RP2a為2SP1，RP2b為2SP3。為進一步開展酶