雌激素對星型膠質(zhì)細胞L型鈣通道調(diào)控機制的研究及對阿爾茨海默病的影響.pdf

1、背景：阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s Disease, AD）是最常見的老年癡呆疾病。晚期患者通常需要照料才能維持生活，為社會和經(jīng)濟經(jīng)帶來了巨大的負擔。越來越多的證據(jù)顯示，AD是一種突觸衰竭（ synaptic failure）疾病。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與鈣通道相關(guān)的鈣調(diào)節(jié)異常與 AD的突觸功能障礙和病理改變相關(guān)，而突觸功能異常又與認知功能衰退有關(guān)。因此，深入研究鈣通道的分子調(diào)節(jié)機制如何參與了 AD的病理生理過程對治療AD具有重要意義。

2、>　　L型鈣通道（L-type calcium channel，LTCC）是調(diào)節(jié)鈣離子(Ca2+)進入細胞內(nèi)的主要途徑。主要由是由α1、β、γ、α2/δ五個亞單位構(gòu)成。其中鈣離子通道α1亞基（Cav1.1-1.4）是主要的功能單位，它構(gòu)成鈣離子傳導的孔道，電壓感受器和門控調(diào)節(jié)裝置，能單獨發(fā)揮鈣通道的功能，也是許多藥物的作用部位基因。哺乳動物的大腦，主要表達Cav1.2和Cav1.3兩種亞型，有研究表明，在AD鼠中，星形膠質(zhì)細胞高表達 C

3、av1.2，可能和 Aβ的形成有關(guān)。鈣通道介導的鈣內(nèi)流在突觸可塑性起著關(guān)鍵性作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與鈣通道相關(guān)的鈣調(diào)節(jié)異常與 AD的突觸功能障礙和病理改變相關(guān)。研究顯示，在突觸重塑中，AC起著積極主動的作用。因此，研究AC上的鈣通道對AD的治療有重要意義。
　　LTCC的阻斷劑逆轉(zhuǎn)了Aβ所致的LTP損害。但直接阻斷LTCC,可能干擾了正常的細胞內(nèi)鈣穩(wěn)定和學習記憶功能。精細調(diào)控LTCC，而不是直接阻斷，是治療AD的另一策略。越來越多的研究顯

4、示，E2在不同類型的神經(jīng)炎癥性及神經(jīng)退行性病變中所起的神經(jīng)保護作用均與細胞內(nèi)的鈣平衡有關(guān)，它具有明顯的調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣穩(wěn)定的作用，并能調(diào)控 LTCC的功能。星型膠質(zhì)細胞同樣表達 ER，同神經(jīng)元一樣，是E2潛在的調(diào)節(jié)靶點。然而，是否E2調(diào)節(jié)星型膠質(zhì)細胞中Cav1.2的表達，目前仍不清楚。
　　目的：通過體外培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞，探索E2對星形膠質(zhì)細胞Cav1.2的調(diào)控機制，了解在Aβ等神經(jīng)炎癥樣病理條件下，E2對Cav1.2的調(diào)節(jié)作用是

5、否有所改變，以及驗證Cav1.2在 E2對學習和記憶中的影響，以期尋找針對AD的新藥物靶點。
　　方法：通過酶消法及搖床振搖法純化星形膠質(zhì)細胞，建立穩(wěn)定的原代星型膠質(zhì)細胞培養(yǎng)模型，并經(jīng)免疫熒光（Immunofluorescence，IF）的方法鑒定星形膠質(zhì)細胞的純度。采用免疫印跡（Western blot，WB）方法進行E2及ER亞型介導的Cav1.2蛋白表達的調(diào)節(jié)作用。通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcript

6、ion polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測Cav1.2 mRNA水平，使用轉(zhuǎn)錄水平抑制劑放線菌素D(Actinomycin D，Atc-D)以及蛋白合成抑制劑放線菌酮（Cycloheximide，CHX）觀察E2對基因表達的效果。為了了解Cav1.2的蛋白降解途徑以及E2對其途徑可能的影響，分別運用了泛素化抑制劑MG132及溶酶體抑制劑氯喹（Choloroquine，CQ）。Aβ、H2O2、LPS三者

7、能刺激星型膠質(zhì)細胞的活化，應用WB檢測了，上述炎癥情況下，E2對Cav1.2表達的影響。在動物模型試驗中，我們選用了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠為實驗對象，并建立了卵巢切除（Ovariectomize，OVX）小鼠模型，皮下注射參與調(diào)節(jié)Cav1.2的ER，運用免疫組化的方法，檢測了腦內(nèi)tau蛋白的磷酸化水平，并選擇了條件恐懼實驗，進一步了解雌激素對 AD的防治是否具有重要意義。
　　結(jié)果：實驗證明 E2呈濃度依賴的方式上調(diào)了星型膠質(zhì)細

8、胞的Cav1.2蛋白的表達，且該上調(diào)作用能被雌激素受體（ER）拮抗劑ICI-182,780阻斷。選擇性雌激素α受體（ERα）激動劑PPT和擇性雌激素β受體（ERβ）激動劑DPN均上調(diào)了星型膠質(zhì)細胞中Cav1.2蛋白的表達，兩者的作用同樣成濃度依賴的方式；其中，PPT上調(diào) Cav1.2的作用與 E2上調(diào) Cav1.2的作用類似。進一步研究發(fā)現(xiàn)，E2未改變Cav1.2的mRNA水平；同時，E2上調(diào)的Cav1.2蛋白表達被放線菌酮（CHX）而

9、不是被放線菌素（Atc-D）抑制,提示E2調(diào)節(jié)Cav1.2蛋白的表達發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。我們還發(fā)現(xiàn)，E2可能是通過減慢Cav1.2蛋白的泛素化降解率從而增加其表達。分別給予不同的神經(jīng)炎癥樣刺激因素Aβ, H2O2, LPS，均增加了Cav1.2的表達，然而，加用E2后，這種上調(diào)的作用被抑制。E2對通過 ERα的介導上調(diào)了 Cav1.2，然而在有炎癥因素刺激的情況下，E2發(fā)揮了協(xié)調(diào)抑制作用，拮抗了由Aβ, H2O2上調(diào)的Cav1.2的作用，

10、這可能系雌激素對神經(jīng)系統(tǒng)病變起保護作用的一種可能的機制。然而，這種協(xié)調(diào)抑制作用在LPS組中未出現(xiàn)，考慮LPS上調(diào)Cav1.2可能有著和E2不一樣的調(diào)節(jié)機制。
　　在AD腦中,tau蛋白呈現(xiàn)過度磷酸化,從微管上解離,由可溶性的tau蛋白變?yōu)椴蝗苄缘膖au蛋白,進而形成雙螺旋狀或直的神經(jīng)原纖維,導致神經(jīng)原纖維纏結(jié)。研究證實 A C激活在 A D中 tau蛋白病變的形成和發(fā)展上具有決定性的意義,可以加重AD的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。我們已經(jīng)在離

11、體實驗中證明，PPT對Aβ上調(diào) Cav1.2的表達有拮抗作用，故在動物實驗中，選用APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，建立 OVX模型，檢測了 PPT對 tau磷酸化的作用，結(jié)果顯示，經(jīng) PPT干預后能有效逆轉(zhuǎn)AD小鼠海馬CA3區(qū)的tau262過度磷酸化水平，我們推測這種逆轉(zhuǎn)作用，可能AC也有積極參與。在研究E2及ER對學習記憶影響的實驗中，我們利用了敏感度比較高的條件恐懼實驗，但可能樣本數(shù)量較少可能性大，該部分提示為陰性結(jié)果。進一步我們需加大樣