糖尿病性膀胱病逼尿肌無力的機制研究和干細胞治療初探.pdf

1、背景及目的:
　　糖尿病性膀胱病(Diabetic cystopathy，DCP)晚期主要表現為失代償性的膀胱興奮性下降和逼尿肌收縮無力，導致排尿困難、殘余尿增加、慢性尿潴留及充溢性尿失禁等臨床癥狀，現有理論認為發(fā)生機制可能包括:支配膀胱的相關神經損害，膀胱逼尿肌功能受損，膀胱泌尿上皮功能改變，膀胱間質內膠原纖維比例降低和彈力纖維合成增加和尿道協(xié)調失衡等。而現在越來越來的研究證實，晚期逼尿肌細胞的功能異常和數量減少是導致膀胱收縮無

2、力進而出現一系列相應癥狀的最直接原因。本課題擬深入研究和闡明逼尿肌細胞在DCP晚期逼尿肌無力發(fā)生中的病理基礎和分子機制，并初步觀察尿源性干細胞的修復治療效果。
　　方法:
　　第一部分:研究ICC細胞興奮異常在DCP逼尿肌無力中的作用
　　我們通過腹腔注射鏈脲佐菌素加高脂高糖飲食建立大鼠糖尿病模型，將大鼠分為兩組:1.正常大鼠:NC;2.DCP大鼠:DCP。通過胰島素抵抗實驗、膀胱測壓和纖維化分析鑒定模型建模成功;通過

3、qRT-PCR、western blot和免疫熒光染色分析HCN通道核酸和蛋白表達分布差異;原代分離培養(yǎng)膀胱ICC細胞后，通過膜片鉗檢測HCN介導的Ih電流大小和通道活性差異;通過離體肌條張力測定和細胞內鈣離子濃度測定比較HCN通道對膀胱收縮力和鈣離子活動的作用差異;透射電鏡分析ICC細胞數量和其上小窩結構的表達差異，Western blot檢測小窩蛋白表達變化;免疫熒光染色和免疫共沉淀共定位小窩蛋白3和HCN通道蛋白，證明兩者間相互作

4、用;使用siRNA轉染原代ICC細胞下調Caveolin-3表達水平，觀察比較Caveolin-3對HCN通道表達和通道功能活性的影響。
　　第二部分:探討AGEs介導DCP逼尿肌細胞凋亡的作用機制
　　收集DCP患者膀胱樣本，檢測AGEs和RAGE的表達差異。再通過第一部分建模方法建立DCP大鼠模型，SD大鼠分為四組:正常大鼠:NC;DCP大鼠:DCP;DCP大鼠腹腔注射ALT-711治療:DCP+ALT-711;DCP大

5、鼠口服AG治療:DCP+AG。通過檢測以下內容指標，觀察DCP大鼠的疾病狀態(tài)特點和ALT-711、AG的治療效果:免疫組化和Elisa實驗檢測血清、胰腺內胰島素含量和膀胱內AGEs的含量;繪制大鼠體重和空腹血糖變化曲線;膀胱測壓和離體肌條張力測定檢測膀胱排尿和收縮力變化;Western blot檢測RAGE、氧化應激和細胞凋亡關鍵調控蛋白SOD-2、Caspase-3的表達差異，觀察和細胞凋亡密切的MAPK信號通路相關蛋白表達差異;TU

6、NEL染色和Masson染色檢測大鼠膀胱組織細胞凋亡和纖維化改變;原代分離培養(yǎng)膀胱逼尿肌細胞，通過外源性AGEs-BSA培養(yǎng)處理后，觀察其對細胞內活性氧ROS的濃度影響，探討時間和濃度依賴特性，檢測相關蛋白RAGE和SOD-2的表達變化;通過轉染siRNA-RAGE和siRNA-p38-MAPK后下調目的基因表達水平，檢測細胞內活性氧濃度變化和細胞凋亡百分比，證實該信號通路在AGEs誘導細胞氧化應激和細胞凋亡中的作用。
　　第三部

7、分:初步觀察尿源性干細胞對DCP逼尿肌無力大鼠模型的治療作用
　　原代分離培養(yǎng)人尿源性干細胞，初步觀察其增值和轉分化特性。將分離培養(yǎng)的人尿源性干細胞轉染攜帶eGFP的慢病毒進行標記，通過尾靜脈注射進入DCP大鼠體內，觀察人尿源性干細胞在體內重要器官的歸巢情況和治療效果，實驗分組為:正常大鼠:NC;DCP大鼠:DCP;DCP大鼠注射人尿源性干細胞治療:DCP+USCs。觀察了大鼠血糖、體重、膀胱濕重、血生化指標、大鼠糖代謝情況變化;

8、膀胱測壓和離體肌條收縮實驗觀察膀胱排尿功能和收縮力恢復情況;HE染色、Masson染色和TUNEL染色觀察大鼠逼尿肌纖維化和細胞凋亡情況;Westemblot蛋白定量:α-SMA，Caspase-3。
　　結果:
　　1.低劑量鏈脲佐菌素腹腔注射聯合高脂高糖高蛋白飲食可較好的模擬2型糖尿病模型，注射12周后大鼠膀胱出現糖尿病性膀胱病逼尿肌無力的典型表現;DCP大鼠膀胱中HCN通道四個亞型的核酸和蛋白表達量降低，HCN介導的I

9、h電流密度下降;HCN通道蛋白位于小窩結構域內，小窩及其結構蛋白Caveolin-3在DCP時表達降低，該蛋白可與HCN通道的四個亞型發(fā)生相互作用并正向調控HCN通道介導的Ih電流。
　　2.DCP患者膀胱組織中AGEs含量和RAGE表達均顯著增加;口服氨基胍和腹腔注射阿拉氯胺治療DCP大鼠后，兩者均可在體阻斷AGEs的產生，進而抑制細胞氧化應激和凋亡，改善DCP大鼠的排尿功能和肌條收縮力;AGEs可在體外呈時間和濃度依賴性地誘導

10、逼尿肌細胞活性氧ROS和細胞凋亡，使用siRNA干擾RAGE和p38-MAPK的表達后，AGEs誘導的細胞內ROS增加和細胞凋亡比率明顯受到抑制，相應的標志蛋白Caspase-3、SOD-2的表達也有所降低。
　　3.成功在人尿液中分離提取了原代尿源性干細胞，并能有效增殖傳代，使用PDGF5ng/ml+TGFβ2.5ng/ml、VEGF30ng/ml分別培養(yǎng)尿源性干細胞14天后，部分干細胞分化成上皮細胞和平滑肌細胞。每隔一周進行尾

11、靜脈注射使用攜帶eGFP基因的尿源性干細胞后，干細胞可在胰腺歸巢，但未能在膀胱中檢測到歸巢細胞。但注射干細胞后，DCP膀胱纖維化和逼尿肌細胞凋亡得到有效機制，DCP大鼠逼尿肌收縮力和排尿功能也有不同程度改善。
　　結論:
　　1.膀胱ICC細胞的數量減少和其HCN通道蛋白表達和功能活性降低可能是DCP逼尿肌無力發(fā)生的重要分子基礎，小窩結構域內的Caveolin-3可與HCN通道的四個亞型發(fā)生相互作用并調控HCN通道的活性。<