骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對1型糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞病的治療及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　 近年有學(xué)者提出了一個(gè)新概念-足細(xì)胞病(podocytopathy)，即以足細(xì)胞數(shù)量和(或)密度減少、基底膜增厚、腎小球基質(zhì)成分改變以及足突融合為特征的腎小球疾病。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。近年來，隨著對腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)和功能改變的研究，發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞病在DN發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。DN病理早期表現(xiàn)為足細(xì)胞數(shù)量減少和裂孔隔膜相

2、關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，由此引發(fā)基底膜增厚，濾過膜功能障礙，最終造成大量蛋白尿和腎功能衰竭。因此，揭示足細(xì)胞損傷再生機(jī)理，促進(jìn)足細(xì)胞有益的再生是糖尿病腎病足細(xì)胞損傷治療中的一個(gè)關(guān)鍵問題。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，具有易獲得、易培養(yǎng)、低免疫原性、能在宿主體內(nèi)長期存活、易于外源基因轉(zhuǎn)染和長期表達(dá)等特點(diǎn)。研究已發(fā)現(xiàn)MSC對DN有良好的治療作用。但有關(guān)MSC治療

3、DN的機(jī)制仍未明確。
　　 本課題通過建立1型DN大鼠模型，研究MSC對DN足細(xì)胞病的治療作用和對足細(xì)胞損傷的修復(fù)作用，探討其可能的保護(hù)機(jī)制。
　　 方法：
　　 本課題分2部分進(jìn)行探討。
　　 第一部分：分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定細(xì)胞上清液中(Vascular endothelialgrowt

4、h factor，VEGF)和(Bone morphogenetic protein-7，BMP-7)的含量，以了解MSC是否分泌VEGF和BMP-7；攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluoresceneceprotein，EGFP)基因的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、標(biāo)記MSC。
　　 第二部分：探討MSC對DN大鼠的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)分為4組：正常對照組(Normalcontrol group，NC)、DN模型組(Diab

5、etic nephropathy group，DN)、DN+medium組(DN+medium)、DN+干細(xì)胞治療組(DN+MSC)。在DN模型成立后(STZ誘導(dǎo)后第30天)，1ml MSC(2×106 cell/ml)和等量培養(yǎng)液分別同時(shí)注射入治療組和DN+medium組大鼠左腎動(dòng)脈。分別于MSC注射后24小時(shí)、60天觀察MSC在腎臟定植情況。于治療60天后，處死四組大鼠。觀察各組大鼠血糖(Blood glucose，Glu)，腎重(

6、Kidney weight，KW)，體重(Body weight，BW)、腎質(zhì)量/體質(zhì)量計(jì)算腎臟肥大指數(shù)(KI)、腎功能包括24小時(shí)尿蛋白排泄率(Urine albuminuria excretion rate，UAER)和血肌酐(Serum creatinine，Scr)等代謝和生化指標(biāo)的變化。處死大鼠后，留取腎臟標(biāo)本進(jìn)行以下指標(biāo)的觀察。PAS染色行腎組織病理學(xué)檢查，普通光學(xué)顯微鏡觀察腎小球系膜基質(zhì)增生變化，并計(jì)算腎小球硬化指數(shù)(Gl

7、umerulosclerosis index，GSI)判斷腎小球硬化程度；透射電子顯微鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)的變化，包括腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)厚度、足細(xì)胞(podocyte)形態(tài)和數(shù)量的變化，并計(jì)算足突寬度(podocyte foot processes width，F(xiàn)PW)以了解足細(xì)胞消失、融合情況；Western blot法和免疫熒光染色法檢測腎臟足細(xì)胞特異性蛋白nephrin和

8、podocin的表達(dá)和定位，以了解足細(xì)胞數(shù)目和標(biāo)記蛋白的變化；用ELISA法檢測分別檢測各組大鼠腎皮質(zhì)VEGF和BMP-7(促足細(xì)胞生存因子)的含量，以了解MSC在受損腎臟旁分泌機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：
　　 1、通過全骨髓培養(yǎng)法，成功分離、培養(yǎng)了大鼠MSC，第3-5代細(xì)胞活性良好，呈貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，適于后續(xù)試驗(yàn)。表面抗原鑒定及成骨、成脂肪誘導(dǎo)結(jié)果顯示所培養(yǎng)細(xì)胞為MSC。
　　

9、 2、相較于普通完全培養(yǎng)基，MSC細(xì)胞上清液VEGF和BMP-7含量顯著增高(P<0.05)，提示MSC體外培養(yǎng)可分泌VEGF和BMP-7。
　　 3、攜帶有EGFP的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)MSC，在感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)為20時(shí)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高，EGFP陽性細(xì)胞比率達(dá)約80%。轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞未見明顯毒性表現(xiàn)或生長不良現(xiàn)象。
　　 第二部分：
　　 1、STZ單次大劑量注射后，連續(xù)3

10、天監(jiān)測隨機(jī)血糖，血糖≥16.7mmol/L判定1型糖尿病模型建立成功；成模后30天，尿常規(guī)檢測出尿微量白蛋白定性陽性，判定DN形成。
　　 2、在注射MSC24小時(shí)及60天后，激光共聚焦顯微鏡檢測到MSC在大鼠左側(cè)腎臟腎小球定植。注射后24h和60天，分別有約20%和3%腎小球可見明顯1-2個(gè)綠色熒光陽性區(qū)域，隨著時(shí)間延長，綠色熒光強(qiáng)度逐漸減弱。
　　 3、與NC大鼠比較，三組DN大鼠Glu、KW、KI、Scr、24h

11、UAER均顯著增高(P<0.05)，BW顯著降低；相較于DN組和DN+medium組大鼠，MSC治療組大鼠KW、KI、Scr、24h UAER均顯著下降(P<0.05)，但Glu、BW無明顯變化(P>0.05)。
　　 4、與NC大鼠比較，三組DN大鼠腎組織VEGF表達(dá)顯著增加，BMP-7表達(dá)顯著降低；相較于DN組和DN+medium組，MSC治療組大鼠腎組織中BMP-7表達(dá)顯著增加(P<0.05)，VEGF表達(dá)無明顯差異(P>

12、0.05)。
　　 5、光鏡觀察MSC治療組大鼠腎臟病理較其他兩組DN大鼠腎小球體積減小，系膜擴(kuò)張減輕、系膜基質(zhì)增生減少；電鏡觀察MSC治療組大鼠較其他兩組DN大鼠腎臟基底膜厚度減少，足細(xì)胞數(shù)量增多，足突增寬、扁平及足突融合、消失情況明顯改善，F(xiàn)PW數(shù)值較對照組明顯減小(P<0.05)提示足細(xì)胞數(shù)量增加。
　　 6、Western blot和免疫熒光染色結(jié)果均顯示，MSC治療使大鼠腎小球足細(xì)胞特異性蛋白nephrin和p