骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療糖尿病心肌病的研究.pdf

1、隨著糖尿病(DM)發(fā)病人數(shù)的日益增多,糖尿病的相關(guān)并發(fā)癥也成為研究的重點之一.糖尿病心肌病(DCM)已成為老年DM患者死亡的主要原因.早在1972年Rubler等首次提出糖尿病心肌病這一診斷以來,糖尿病心肌病也逐漸被人們所認識.糖尿病心肌病是一種特異性的心肌病,其病理表現(xiàn)為心肌細胞的凋亡和壞死,微循環(huán)障礙和心肌間質(zhì)纖維化,臨床表現(xiàn)為心肌舒張和收縮功能障礙,心律失常;晚期可出現(xiàn)充血性心力衰竭.總之,糖尿病心肌病為代謝所致的廣泛性、彌漫性的

2、心肌損害. 骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells,MSCs)是一種從骨髓中分離獲得的成體干細胞.骨髓基質(zhì)干細胞具有易于獲取、分離方便、多向分化潛能和無免疫反應(yīng)等特點,在細胞移植和基因治療方面具有良好的應(yīng)用前景.近年來,基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),骨髓基質(zhì)干細胞可以在梗死的心肌組織中分化為心肌樣細胞、血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞,并進一步形成血管樣結(jié)構(gòu).進一步研究認為,心肌缺血微環(huán)境能誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細胞定向分化.同時,骨髓基質(zhì)

3、干細胞能合成和分泌大量的促細胞和血管生長因子,如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),肝細胞生長因子(HGF),胰島素樣生長因子等(GGF-1)等.在缺血性心肌病的研究中發(fā)現(xiàn)移植骨髓基質(zhì)干細胞的移植能阻止左心室的重構(gòu),在擴張性心肌病的大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)干細胞能抑制心肌的纖維化.但干細胞移植治療糖尿病心肌病的研究還較少見.本課題既是研究基質(zhì)骨髓干細胞移植對糖尿病心肌病心功能的影響,并探討其可能的機制. 材料和方法: 7-8 周的雄性

4、SD大鼠80只腹腔注射STZ(60mg/kg),每周檢測血糖,血糖大于300mg/dl即認為糖尿病建模成功.血糖穩(wěn)定8周后糖尿病心肌病大鼠模型建立成功.骨髓基質(zhì)干細胞 (bone marrow stromal cells,MSCs) 由雄性的8周SD大鼠的脛腓骨獲取,沖洗后經(jīng)細胞培養(yǎng)并進行移植前流式細胞儀檢測傳3-4代后備用.在骨髓基質(zhì)干細胞在體外用DAPI(4′6-Diamidino-2-Phenylindole)標記后,以每只5×1

5、0<'6>個細胞經(jīng)股靜脈回輸,對照組回輸同體積的PBS. 4 周后取在對照組,糖尿病(DCM)組及移植組間(DCM+MSC)大鼠,先行心臟多普勒超聲檢查,再處死大鼠后取心肌標本行免疫熒光,免疫組化及PT-PCR 方法檢測金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2及MMP-9及TIMP m-RNA的表達,并分析MMP-2的蛋白活性,Western-blot 法分析 TnT 表達. 結(jié)果:1:經(jīng)體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細胞多數(shù)表達CD44及CD9

6、0,而CD45的表達為陰性.2:移植前的糖尿病心肌病(DCM)大鼠和對照組基線特征的對比在移植前DCM組血糖明顯高于對照組 (p<0.01),體重明顯低于對照組(p<0.01),左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)在兩組間無顯著性差異,但通過體重校正后DCM組顯著高于對照組(p<0.01),左室后壁厚度(LVPW),相對室壁厚度(RWT)及室壁縮短率(FS)在DCM組是低于對照組(p<0.01,p<0.05,p<0.01),左房內(nèi)經(jīng)(LAD)在

7、DCM組略高,但未達到統(tǒng)計學(xué)差異.3:細胞移植后4周3組間基線特征的對比在回輸MSC后4周,在DCM及DCM+MSC組的血糖水平仍較高 (p<0.01), 3組間的LVDd無差異,體重校正后LVDd和心臟的重量在DCM組是升高的(p<0.01,p<0.05與對照組比),但通過MSC移植后有所下降,但差異未達到統(tǒng)計學(xué)意義.LVPW,RWT在DCM組是低于對照組(p<0.01,p<0.05),通過MSC移植后,LVPw和RWT升高,僅有LN

8、PW的升高有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),室間隔厚度(IVSd),LAD和FS在組間均未達到統(tǒng)計學(xué)差異.4:干細胞移植后誘導(dǎo)的細胞和血管的新生經(jīng)蘭熒光標記的MSC細胞在移植后的4周能在心肌中檢測到.免疫熒光也證實移植的MSC細胞troponin T 和肌球蛋白輕鏈表達為陽性,這說明移植細胞的一部分能轉(zhuǎn)化為表達troponin T 和肌球蛋白輕鏈的心肌細胞.微血管密度的檢測發(fā)現(xiàn)在DCM組心肌微血管數(shù)量與對照組比明顯降低(2.71±0.29個

9、/0.2mm<'2>比5.46±0.61個/0.2mm<'2>,p<0.01),通過MSC移植后DCM組心肌微血管密度明顯增加并有統(tǒng)計學(xué)意義.(4.38±0.25個/0.2mm<'2>,p<0.05比DCM組.)5:MSC移植改善心肌的纖維化Masson's染色證實了在DCM組與對照組和MSC組相比,心肌及微血管周圍存在明顯的間質(zhì)纖維化. 纖維化的計數(shù)面積DCM組也高于對照組(p<0.01),MSC移植后能改善糖尿病大鼠的心肌纖維化,但

10、未達到統(tǒng)計學(xué)差異. MMP-2的活性在DCM組與對照組相比是降低的(72±4﹪of control,p<0.01),MSC移植后活性升高并有統(tǒng)計學(xué)意義(97±3﹪ofcontrol in DCM+MSC group,p<0.01比DCM組).但在mRNA水平,MMP-2的表達較低,而且在3組中無差異. MMP-9的mRNA水平在DCM組與對照組相比是顯著升高的(p<0.01),MSC移植后表達下降并有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.

11、01),但MMP-9在mRNA水平的表達仍然比對照組高(p<0.01),.但TIMP-1 mRNA水平在DCM組是明顯降低的(p<0.01),在MSC移植后有所升高,但未達到統(tǒng)計學(xué)意義.6:Troponin T的Western blot表達Western blot證實在DCM組與對照組比較Troponin T的表達是降低的(p<0.01).但在MSC移植后表達有所升高,但未達到統(tǒng)計學(xué)差異. 結(jié)論: 通過上述的研究,我們得