原位純化固定化DAAO酶技術(shù).pdf

1、酶是生物催化的核心，酶催化多采用固定化酶法。但是傳統(tǒng)的酶固定化方法中，酶的純化和固定化需要分步完成，多步操作會造成生產(chǎn)成本的增加以及酶的損失，固定化載體的成本也是影響固定化酶工業(yè)應(yīng)用的重要因素之一。 本文借鑒固定化金屬螯合層析技術(shù)(IMAC)這一較為成熟的蛋白純化方法，研究原位純化固定化酶技術(shù)。傳統(tǒng)IMAC法是在目標蛋白末端引入六聚組氨酸標簽(His-tag)，當粗酶液流經(jīng)金屬螯合載體時，帶His-tag的重組蛋白即通過金屬螯合

2、力與載體上的金屬離子螯合起來，但是由于結(jié)合力較弱，結(jié)合上去的酶容易脫落，因此His-tag標簽只適用于蛋白的純化，而不能用于酶的固定化。 因此本文選擇以DAAO酶為研究對象，從本實驗室構(gòu)建的基因工程菌JM105/pGEMKT-R-DAAO出發(fā)，基于IMAC理論，利用基因工程方法將一種有別于我們常見的His-tag標簽的強特異性吸附標簽DAAO-Lab引入目標蛋白末端，將DAAO更牢固地結(jié)合在載體上，創(chuàng)建了一種適合工業(yè)應(yīng)用，純化、

3、固定化一步完成的固定化酶。并建立一個應(yīng)用IMAC技術(shù)制備工業(yè)用固定化酶的方法。從而解決了目前工業(yè)用酶在固定化中存在的步驟復(fù)雜、成本高等問題。 構(gòu)建基因工程菌JM105/pGEMKT-R-DAAO-Lab，首先在在實驗室原有質(zhì)粒pGEMKT-R-DAAO下游成功插入了新的標簽結(jié)構(gòu)Lab基因片段，成功在大腸桿菌JM105中表達了新的融合蛋白DAAO-Lab。而且該固定化酶可以用0.3M EDTA將蛋白和金屬離子一起洗脫下來，載體可重