固定化酶

1、Enzyme Engineering酶工程,第三章 固定化酶,第一節(jié) 概述第二節(jié) 固定化酶的性質(zhì)及其影響因素第三節(jié) 固定化酶的制備第四節(jié) 固定化細(xì)胞第五節(jié) 固定化輔酶和原生質(zhì)體第六節(jié) 酶反應(yīng)器和固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用,第一節(jié) 概述,圖6-1 生物催化劑作用方式示意,固定化酶的發(fā)展史,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性載體,水不溶性酶（固定化酶）,固定化技術(shù),第一節(jié) 概述,二． 固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)

2、 多次使用 可以裝塔連續(xù)反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)： 純化簡(jiǎn)單 提高產(chǎn)物質(zhì)量 應(yīng)用范圍廣缺點(diǎn)： 首次投入成本高 大分子底物較困難,,,第一節(jié)結(jié)束,點(diǎn)擊返回,第二節(jié) 固定化酶的性質(zhì)及其影響因素,一． 影響固定化酶性質(zhì)的因素二． 固定化后酶性質(zhì)的變化三． 評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo),一． 影響固定化酶性質(zhì)的因素,1

3、． 酶本身的變化，主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。,一． 影響固定化酶性質(zhì)的因素,2． 載體的影響（1） 分配效應(yīng)（2） 空間障礙效應(yīng)（3） 擴(kuò)散限制效應(yīng)3. 固定化方法的影響,二．固定化后酶性質(zhì)的變化,1． 固定化對(duì)酶活性的影響：酶活性下降，反應(yīng)速度下降原因：酶結(jié)構(gòu)的變化 空間位阻,二． 固定化酶的性質(zhì),2． 固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響（1） 操作穩(wěn)定性提高

4、（2） 貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。 (3 ) 對(duì)熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。 (4 ) 對(duì)分解酶的穩(wěn)定性提高。（5） 對(duì)變性劑的耐受力升高,2 ．固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：,a. 固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接。b. 酶活力的釋放是緩慢的。c. 抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。,3． pH的變化,PH對(duì)酶活性的影響：（1） 改變酶的空間構(gòu)象（2）影響酶的催化基團(tuán)的解離（3）影響酶的結(jié)合基團(tuán)的

5、解離（4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。,pH對(duì)固定化酶的影響,1） 載體帶負(fù)電荷，pH向堿性方向移動(dòng)。 微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液稱為宏觀環(huán)境。,3． pH的變化,載體帶正電荷，pH向酸性方向移動(dòng)。（2）產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)體系pH的影響催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高；反之則低,4． 最適溫度變化,一般與游離酶差不多，但有些會(huì)

6、有較明顯的變化。5． 底物特異性變化作用于低分子底物的酶 特異性沒(méi)有明顯變化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特異性往往會(huì)變化。,,,6． 米氏常數(shù)Km的變化，Km值隨載體性質(zhì)變化,（1） 載體與底物帶相同電荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的親和力。（2） 載體與底物電荷相反，靜電作用，Km'<Km,,三． 評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：,1． 酶活定義（IU)：在特定條件下

7、，每一分鐘催化一個(gè)微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個(gè)酶活單位。1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min =6*106IU2. 酶比活定義（游離）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力單位,三． 評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：,1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位。 或：?jiǎn)挝幻娣e（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、

8、酶板）。2. 操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。 連續(xù)測(cè)活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時(shí)間（t1/2）,三． 評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：,3. 4. 或稱偶聯(lián)效率，活力保留百分?jǐn)?shù)。5.相對(duì)酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對(duì)酶活力,四 固定化酶的活力測(cè)定方法介紹,1. 振蕩測(cè)定法：2. 酶柱測(cè)定法：,四 固定化酶的活力測(cè)定方法介紹,3. 連續(xù)測(cè)定法利用連續(xù)

9、分光光度法等測(cè)定方法可以對(duì)固定化酶反應(yīng)液進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，從而測(cè)定固定化酶的酶活力。,第二節(jié)固定化酶的性質(zhì)及其影響因素提要,影響固定化酶性質(zhì)的因素固定化酶的性質(zhì)評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo),酶本身的變化載體的影響,固定化對(duì)酶活性的影響固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響最適pH的變化最適溫度變化底物特異性與游離酶不同米氏常數(shù)Km的變化,評(píng)價(jià)指標(biāo)活力測(cè)定方法,,,,,第二節(jié)結(jié)束,點(diǎn)擊返回,第三節(jié) 固定化酶的制備,一． 一般方法及特點(diǎn)二．

10、 酶的固定化方法,一． 一般方法及特點(diǎn),關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)墓潭ɑ椒ê捅匾妮d體以及穩(wěn)定性研究、改進(jìn)。1． 四大類方法：吸附法（包括電吸附法）結(jié)合法（無(wú)機(jī)多孔材料）交聯(lián)法（雙功能試劑） 包埋法（微膠囊法）,各類固定化方法的特點(diǎn)比較:,2． 選擇方法依據(jù)：,（1） 酶的性質(zhì)（2） 載體的性質(zhì)（3） 制備方法的選擇,3． 固定化后酶的考察項(xiàng)目：,（1） 測(cè)定固定化酶的活力，以確定固定化過(guò)程的活力回收率。（2） 考察

11、固定化酶穩(wěn)定性（ 2） 考察固定化酶最適反應(yīng)條件,二． 酶的固定化方法,（一） 吸附法（二）結(jié)合法（三）交聯(lián)法（四） 包埋法（entrapping method）,（一） 吸附法,1． 物理吸附：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。 選擇載體的原則 （1）要有巨大的比表面積 （2） 要有活潑的表面（3） 便于裝柱進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)。,（二）結(jié)合法,1 離子鍵結(jié)合法2 共價(jià)鍵結(jié)合法☆,1 離子鍵結(jié)合法

12、,概念常用載體:DEAE-纖維素， DEAE-葡聚糖凝膠使用注意：pH、離子強(qiáng)度、溫度,2 共價(jià)鍵結(jié)合法,（1）概念（2）可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)： 游離氨基， 游離羧基， 巰基， 咪唑基， 酚基， 羥基， 甲硫基， 吲哚基，二硫鍵（3）常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無(wú)機(jī)載體,共價(jià)鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式”,首先載體上引進(jìn)活潑基團(tuán)

13、 關(guān)鍵 然后活化該活潑基團(tuán) 最后此活潑基團(tuán)再與酶分子上某一基團(tuán)形成共價(jià)鍵,,（4）載體活化的方法,A．重氮法B．疊氮法C．烷基化反應(yīng)法D．硅烷化法E．溴化氰法,A．重氮法,反應(yīng)示意式如下,A．重氮法,目前在我們國(guó)內(nèi)用的

14、較多的載體是對(duì)氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等該方法需要載體具有芳香族氨基,A．重氮法,反應(yīng)式及原理,B 疊氮法,例用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶，步驟如下：⑴ 酯化⑵ 肼解⑶ 疊氮化(4) 偶聯(lián),B 疊氮法,對(duì)含有羧機(jī)基的載體，與肼基作用生成含有酰肼基團(tuán)的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物。最后于酶偶聯(lián),C．烷基化反應(yīng)法,含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基

15、團(tuán)的活化載體。,D．硅烷化法,多孔玻璃特點(diǎn)：①機(jī)械強(qiáng)度好，表面積大。②耐有機(jī)溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長(zhǎng)等。,D．硅烷化法,一般常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。,D．硅烷化法,D．硅烷化法,D．硅烷化法,E ．溴化氰法,本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質(zhì)。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。,

16、E ．溴化氰法,（三）交聯(lián)法,借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。,（三）交聯(lián)法常用試劑,常用試劑：戊二醛、異氰酸酯、N，N’乙烯馬來(lái)亞胺、雙重氮聯(lián)苯胺等。應(yīng)用最廣泛的是戊二醛，它兩個(gè)醛基都可以與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基形成席夫堿(shiff),（三）交聯(lián)法的形式,交聯(lián)法有2種形式：酶直接交聯(lián)法

17、 酶輔助蛋白交聯(lián)雙重固定法 （1） 吸附交聯(lián)法（2） 交聯(lián)包埋法,,酶直接交聯(lián)法,在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強(qiáng)度、溫度和反應(yīng)時(shí)間之間的平衡。,酶輔助蛋白交聯(lián),為避免分子內(nèi)交聯(lián)和在交聯(lián)過(guò)程中因化學(xué)修飾而引起酶失活，可使用第二個(gè)"載體"蛋白質(zhì)（即輔助蛋白質(zhì)，如白蛋白、明膠、血紅蛋白等）來(lái)增加蛋白質(zhì)濃度，使酶與惰性蛋白質(zhì)共交聯(lián)。,（1） 吸附交聯(lián)

18、法,先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其他大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)。用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。,（2）交聯(lián)包埋法,把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結(jié)成顆粒很細(xì)的集合體，然后用高分子或多糖一類物質(zhì)進(jìn)行包埋成顆粒。這樣避免顆粒太細(xì)的缺點(diǎn)，同時(shí)制得的固定化酶穩(wěn)定性好。,（四） 包埋法（entrapping method）,定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。,（

19、四） 包埋法,包埋法分為網(wǎng)格型和微囊型1．網(wǎng)格型2．微囊型,1．網(wǎng)格型,(1) 概念 將酶或含酶菌體包埋在凝膠細(xì)微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法,2．微囊型包埋法,是將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。,微囊化法制備固定化酶有兩種方法,① 界面沉淀法②界面聚合法,① 界面沉淀法,這是一種簡(jiǎn)單的物理法，它是

20、利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。,②界面聚合法,是用化學(xué)手段制備微囊的方法。利用油水界面上發(fā)生聚合反應(yīng)形成聚合體而將酶包裹起來(lái)。,②界面聚合法,固定化酶方法研究熱點(diǎn),1 熱處理法： 2 結(jié)晶法： 3 分散法：,第三節(jié)提要,一般方法及特點(diǎn)酶的固定化方法,,吸附法結(jié)合法交聯(lián)法包埋法,,,第三節(jié)結(jié)束,點(diǎn)擊返回,第三章 固定化酶,第一節(jié) 概述第二節(jié) 固定化酶的性質(zhì)及其影響因素第三節(jié) 固定

21、化酶的制備第四節(jié) 固定化細(xì)胞第五節(jié) 固定化輔酶和原生質(zhì)體第六節(jié) 酶反應(yīng)器和固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用,第四節(jié) 微生物、植物和動(dòng)物細(xì)胞固定化,細(xì)胞特性比較,固定化細(xì)胞的特點(diǎn),類型：微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞生理狀態(tài)：死細(xì)胞（完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器） 活細(xì)胞（增殖細(xì)胞、靜止細(xì)胞、完整細(xì)胞）形狀：顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則形狀。 最多使用：顆粒狀珠體使用周期：理論上

22、講，固定化增殖細(xì)胞保持了細(xì)胞原有的全部活性， 只要載體不解體，不污染就可以長(zhǎng)期使用。,概念：,固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞.該細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。,細(xì)胞固定化方法,吸附法包埋法,,酶和細(xì)胞固定化示意圖,吸附法,它主要通過(guò)載體與細(xì)胞間的靜電引力，即細(xì)胞表面與載體之間范德華作用力，離子鍵和氫鍵作用力，才使細(xì)胞固定在載

23、體上的。,影響吸附法的主要因素,（1）Z-電位： Z-電位能近似地代表表面電荷密度的大小（2）細(xì)胞的性質(zhì)和細(xì)胞壁的組成：細(xì)胞壁的電荷性質(zhì)（3）載體的性質(zhì)：特別是玻璃、陶瓷等無(wú)機(jī)材料,包埋固定法,包理法是在細(xì)胞自身并不與凝膠基體發(fā)生化學(xué)鍵合的情況下將其包埋在半透性聚合物顆粒（或膜）內(nèi)的一種固定化方法。包埋法的最大優(yōu)點(diǎn)是能較好的保持細(xì)胞內(nèi)多酶系統(tǒng)的活力，可象游離細(xì)胞那樣進(jìn)行產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)。,包埋法分類,常用載體：瓊脂、海藻酸鈣、角叉

24、菜膠、明膠、聚丙烯酰胺常用凝膠包埋法,舉例海藻酸鈣包埋法,基本原理是：稱取一定量的海藻酸鈉配成水溶液，經(jīng)殺菌冷卻后，與一定體積的細(xì)胞或孢子懸浮液混合均勻，然后用注射器或滴管將冷懸液滴入一定濃度的凝固浴中（常用CaCl2 溶液），形成球狀固定化細(xì)胞,通過(guò)改變載體溶液參數(shù)包埋細(xì)胞,改變載體溶液、操作溫度、鹽濃度、pH值和溶劑等參數(shù)時(shí)，亦可使其轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)，將細(xì)胞包埋其中。,研究熱點(diǎn)——光交聯(lián)樹脂包埋法,例：相對(duì)分子量為1000-3000

25、的光交聯(lián)聚氨酯預(yù)聚物等，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50℃，然后與一定濃度的細(xì)胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射3min，就可制得,固定化細(xì)胞的目的,微生物菌體：不需多次培養(yǎng)、擴(kuò)大，從而縮短了發(fā)酵生產(chǎn)周期植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞,第四節(jié)固定化細(xì)胞提要,特點(diǎn)方法目的,,第四節(jié)結(jié)束,點(diǎn)擊返回,第五節(jié) 固定化原生質(zhì)體和輔酶,一 原生質(zhì)體的制備二 固定化三 舉例四 輔酶固定化,一 原生質(zhì)體的制備,將對(duì)數(shù)

26、生長(zhǎng)期的細(xì)胞收集——懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中——加入水解酶——分離——得到原生質(zhì)體,,二 原生質(zhì)體固定化的方法,將原生質(zhì)替制備好后，把離心收集到的原生質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液，然后采用包埋法制成固定化原生質(zhì)體。,四 輔酶固定化,1 原因有機(jī)輔因子中具有某些特殊的化學(xué)基團(tuán)，參與酶的催化反應(yīng)有機(jī)輔因子在使用過(guò)程中要流失，并且不能自行再生有機(jī)輔因子價(jià)格昂貴——工業(yè)上應(yīng)用全酶的關(guān)

27、鍵是有機(jī)輔因子的保留和再生,輔酶固定化的方法：,2 固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價(jià)偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾后固定在超濾器中。3 輔酶固定化必須解決輔酶在多個(gè)酶之間傳遞的障礙。,輔酶的固定化,輔酶的固定化,輔酶固定化的形式：,第五節(jié) 固定化原生質(zhì)體和輔酶的固定化,原生質(zhì)體輔酶固定化,方法固定化要點(diǎn),原因方法形式,,,,第五節(jié)結(jié)束,點(diǎn)擊返回,第六節(jié) 酶反應(yīng)器和固定化酶（細(xì)胞

28、）的應(yīng)用,酶反應(yīng)器介紹反應(yīng)器選擇的依據(jù)反應(yīng)器和酶穩(wěn)定性固定化酶和細(xì)胞的應(yīng)用（工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、分析化學(xué)、酶電極、親和色譜、環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)、基礎(chǔ)理論研究）,生物催化反應(yīng)器工程,通過(guò)反應(yīng)器型式、操作方式的改變能否使生物催化反應(yīng)效率最大化？將反應(yīng)與傳質(zhì)緊密相關(guān),一．酶反應(yīng)器。,1． 分批攪拌反應(yīng)器。2． 連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器。3． 連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器4． 填充床反應(yīng)器5． 循環(huán)反應(yīng)器6． 流化床反應(yīng)器,1． 分批攪拌反應(yīng)

29、器,反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不需要特殊裝置，適與小規(guī)模試驗(yàn),,,,,2． 連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器,連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器,3． 連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器,,,,,,,,,酶循環(huán),,,,,,4． 填充床反應(yīng)器,旋轉(zhuǎn)填充床,5． 循環(huán)反應(yīng)器,高效內(nèi)循環(huán)生物反應(yīng)器（HCR）,6． 流化床反應(yīng)器,與連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器類似，是讓適量的顆粒狀酶懸浮于反應(yīng)床中，不用攪拌器，而是底物向上流過(guò)固定酶床，因此流速要適當(dāng)控制。,反應(yīng)器選擇,酶的形式：底物的物理性質(zhì)：酶反

30、應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶的穩(wěn)定性操作要求、應(yīng)用和可塑性成本,反應(yīng)器和酶的穩(wěn)定性,反應(yīng)器中酶催化活性損失的原因：酶本身失效酶從載體上脫落載體肢解擴(kuò)散限制效應(yīng),生物催化反應(yīng)－分離耦合反應(yīng)器,Diagram of the enzymatic synthesis of cefaclor with in situ product removal. (1) Complexation reactor, (2) enzymatic reaction re

31、actor, (3) peristaltic pump, (4) sintered-glass (G2), (5) mechanical stirrer.,反應(yīng)－分離耦合反應(yīng)器成功實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物在線分離,青霉素?；干锎呋铣深^孢克羅,產(chǎn)物在線分離策略實(shí)現(xiàn)頭孢克羅半連續(xù)制備,Journal of Molecular Catalysis, 17(2):81-87, 2003. Biotechnology Letters, 2003, 25

32、(14): 1195-1198. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic,2003,26 (1-2):99-104. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2004, 79:480-485.,減壓式反應(yīng)器用于生物催化反應(yīng)中易揮發(fā)產(chǎn)物的在線去除,Wei Dongzhi*, Yu ying, Biocatalysis and Biotransf

33、ormation, 2003,21(3)135-139.,生物催化合成油酸乙基葡萄糖苷酯,減壓式反應(yīng)器用,常規(guī)反應(yīng)器用,二．固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用,1. 固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用2． 固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用3． 固定化酶在分析化學(xué)中應(yīng)用4． 固定化酶和親和色譜5． 固定化酶與環(huán)境保護(hù)6． 新能源開發(fā)中的應(yīng)用7． 固定化酶在基礎(chǔ)理論研究中應(yīng)用,1． 固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用,葡萄糖異構(gòu)酶——世界

34、上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。利用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產(chǎn)低乳糖奶固定化酵母細(xì)胞等微生物可用于生產(chǎn)各種酒類熱點(diǎn)：固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用,2． 固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用,例1固定化青霉素?；?，只要改變pH值等條件，就可以生成不同的產(chǎn)物。,青霉素?；复呋铣深^孢類抗生素,7-ACA as nucleus,青霉素?；复呋铣深^孢類抗生素,7-ACCA or 7-ADCA as nucleus,酶促合成頭孢類抗生素,-- Reve

35、rsible reaction -- Hydrolysis of substrate or product by biocatalyst -- Difficulty of separation of product from reactants,固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用,例2：制造人工腎利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的體外循環(huán)裝置，大大提高了療效。,3．固定化酶在分析化學(xué)中應(yīng)用,酶柱和酶管，可與分光光度計(jì)、熒光計(jì)或電量計(jì)

36、結(jié)合，形成酶電極，進(jìn)行某些物質(zhì)的自動(dòng)分析。,酶電極,特點(diǎn)：快速、方便、靈敏、精確范圍：糖類、抗生素、氨基酸、甾體化合物、有機(jī)酸、脂粉、醇類、胺類以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等要求：酶必須有較強(qiáng)的專一性，并且要有一定的純度。,研究新方向-微生物傳感器,呼吸活性測(cè)定型：電極活性測(cè)定型的微生物傳感器,酶電極,4． 固定化酶和親和色譜,親和技術(shù)的基礎(chǔ)：是生物活性化合物生物特異信息的綜合。利用了生命現(xiàn)象中生物分子間特有的高親和力、高專一

37、性，可逆結(jié)合而設(shè)計(jì)的純化方法是唯一能夠體現(xiàn)待分離物質(zhì)間生物學(xué)功能差異的分離方法,5． 固定化酶與環(huán)境保護(hù),一：環(huán)境監(jiān)測(cè)二：污染物處理。,6． 新能源開發(fā)中的應(yīng)用,H2是重要的能源物質(zhì)，雖然有許多微生物可以產(chǎn)生H2，但產(chǎn)氫系統(tǒng)不穩(wěn)定。有人利用固定化丁酸梭菌連續(xù)產(chǎn)氫，穩(wěn)定性比天然細(xì)胞好。 將植物的葉綠體中的鐵氧還原蛋白氧化酶系統(tǒng)用膠原膜包被，可用于水的光介產(chǎn)生氫氣和氧氣,7． 固定化酶在基礎(chǔ)理論研究中應(yīng)用,闡明酶反應(yīng)機(jī)理揭示酶原激活

38、機(jī)理,酶亞基性質(zhì)的研究,,研究蛋白質(zhì)-核酸分子結(jié)構(gòu),連續(xù)的固定化酶柱進(jìn)行DNA序列分析原理：是測(cè)定DNA聚合時(shí)，以摻入dNTP同時(shí)釋放的焦磷酸判斷是否發(fā)生了聚合反應(yīng)，進(jìn)而確定摻入的是哪種核苷酸從而推導(dǎo)出序列——該系統(tǒng)由連續(xù)的6個(gè)固定化酶柱組成焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、ATP磷酸化酶，熒光酶柱,第六節(jié)結(jié)束,酶反應(yīng)器應(yīng)用,分批攪拌反應(yīng)器。連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器。連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器填充床反應(yīng)器循環(huán)反應(yīng)器