Orexin-A對(duì)性早熟的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的
　　研究促食素(Orexin-A)對(duì)中樞性性早熟(CPP)大鼠性發(fā)育進(jìn)程的影響，觀察Orexin-A干預(yù)后CPP大鼠下丘腦中母源性表達(dá)的基因3(MEG3)及吻肽(Kisspeptin)的表達(dá)，分析Orexin-A、MEG3及Kisspeptin表達(dá)之間的潛在關(guān)系，探討Orexin-A影響CPP的機(jī)制。
　　對(duì)象與方法
　　1.大鼠性早熟模型的建立及動(dòng)物分組
　　5日齡雌性SD大鼠48只，隨機(jī)分為4組:正

2、常對(duì)照組(Group1)，早熟模型組(Group2)，早熟模型+生理鹽水組(Group3)，早熟模型+Orexin-A組(Group4)，每組12只。適應(yīng)性喂養(yǎng)兩天后，模型組大鼠每只皮下注射所配制的300μg達(dá)那唑溶液以建立性早熟模型，正常對(duì)照組每只皮下注射等體積的生理鹽水。對(duì)第4組大鼠，在15日齡時(shí)側(cè)腦注射0.5 nmol/L Orexin-A，一天一次，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。第3組大鼠側(cè)腦注射等體積生理鹽水。當(dāng)大鼠達(dá)到20日齡時(shí)，觀察大鼠陰

3、門開(kāi)口情況，并記錄大鼠陰門開(kāi)口日。自陰門開(kāi)口日起，記錄20天陰門開(kāi)口情況。
　　將每組大鼠進(jìn)一步細(xì)分為青春期啟動(dòng)前階段、青春期啟動(dòng)階段及青春期啟動(dòng)后階段。分別在上述相應(yīng)的階段處死大鼠，取出大鼠卵巢和子宮樣本，根據(jù)器官指數(shù)=器官濕重/體重，計(jì)算卵巢指數(shù)與子宮指數(shù)。迅速分離的下丘腦組織液氮凍存。
　　2.Western blot法
　　將液氮中保存的下丘腦組織取出碾碎后，RIPA裂解組織，使用Bio-Rad蛋白分析試劑盒測(cè)

4、定總蛋白濃度。將所有提取出的蛋白質(zhì)用10％ SDS-PAGE凝膠電泳分離轉(zhuǎn)膜，測(cè)定MEG3及Kisspeptin蛋白水平。
　　3.定量實(shí)時(shí)PCR法(qRT-PCR)
　　使用RNeasy試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量法檢測(cè)下丘腦MEG3和Kisspeptin mRNA的表達(dá)水平。
　　4.染色體免疫沉淀分析（ChIP試驗(yàn)）
　　采用Chip試劑盒分析Kisspeptin啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白的乙?；癄?/p>

5、態(tài)，從而檢測(cè)大鼠下丘腦中乙酰化組蛋白H3和H4與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合能力。
　　5.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
　　DMEM培養(yǎng)HT22細(xì)胞，保持細(xì)胞密度低于80％以防止細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)。構(gòu)建pcDNA-MEG3載體以過(guò)表達(dá)MEG3，使用Lipofectamine2000將pcDNA-MEG3或pcDNA，轉(zhuǎn)染至HT22細(xì)胞，qRT-PCR及Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Kisspeptin的mRNA水平和蛋白水平。ChIP

6、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白H3、H4與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合水平。
　　結(jié)果
　　1.Orexin-A延緩大鼠中樞性性早熟癥狀
　　通過(guò)觀察大鼠陰道開(kāi)口時(shí)間以及2個(gè)規(guī)則的性周期發(fā)生時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組大鼠相比，第2組和第3組大鼠陰道開(kāi)口時(shí)間明顯較早。第4組大鼠與第3組相比，陰道開(kāi)口時(shí)間較晚。四組大鼠中性周期發(fā)生時(shí)間趨勢(shì)與此相同，Orexin-A推遲了性早熟大鼠性周期發(fā)生時(shí)間。在青春期階段，第2組和第3組大鼠的子宮指數(shù)

7、和卵巢指數(shù)均大于第1組大鼠的子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)，第4組大鼠的子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)較第3組小。以上結(jié)果表明，Orexin-A可延緩大鼠中樞性性早熟癥狀。
　　2.Orexin-A抑制中樞性性早熟大鼠下丘腦中MEG3的表達(dá)
　　利用熒光定量PCR檢測(cè)4組大鼠的下丘腦中MEG3水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早熟模型大鼠與正常鼠相比，下丘腦中MEG3表達(dá)增加，而注射Orexin-A逆轉(zhuǎn)下丘腦中MEG3表達(dá)的變化
　　3.Orexin-A抑制中

8、樞性性早熟大鼠下丘腦中Kisspeptin的表達(dá)
　　熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)4組大鼠的下丘腦中Kisspeptin水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早熟模型大鼠與正常鼠相比，下丘腦中Kisspeptin的表達(dá)增加，而注射Orexin-A逆轉(zhuǎn)下丘腦中Kisspeptin表達(dá)的變化。
　　4.Orexin-A降低中樞性性早熟大鼠中乙?；M蛋白H4與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合
　　利用ChIP試驗(yàn)檢測(cè)大鼠中乙?；M蛋

9、白H3和H4與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合能力。結(jié)果示，四組大鼠下丘腦中乙?；M蛋白H3與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合能力無(wú)差異。早熟模型大鼠與正常鼠相比，下丘腦中乙?；M蛋白H4與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合增加，而注射Orexin-A逆轉(zhuǎn)下丘腦中這種結(jié)合的變化。
　　5.體外細(xì)胞培養(yǎng)，HT22細(xì)胞過(guò)表達(dá)MEG3時(shí)組蛋白H4與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合增強(qiáng)，Kisspeptin表達(dá)增加
　　為檢測(cè)MEG3對(duì)Kis

10、speptin的調(diào)控作用，HT22細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3以過(guò)表達(dá)MEG3。ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HT22細(xì)胞過(guò)表達(dá)MEG3，組蛋白H4與Kisspeptin啟動(dòng)子結(jié)合增加。熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)MEG3時(shí)細(xì)胞中Kisspeptin表達(dá)增加。
　　結(jié)論
　　Orexin-A在大鼠中樞性性早熟中發(fā)揮重要作用，能抑制CPP大鼠的下丘腦-垂體-性腺軸的功能，延緩CPP進(jìn)程，降低Kisspepti