2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  克隆、表達(dá)猬迭宮絳蟲27kDa半胱氨酸蛋白酶(Cysteine Protease,CP)基因,優(yōu)化原核表達(dá)條件,并應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測27kDa-CP在成蟲、裂頭蚴不同組織中的分布情況。
  方法:
 ?、俑鶕?jù)NCBI中公布的猬裂頭蚴27kDa半胱氨酸蛋白酶基因序列(27kDa-CP,D63670),提取蛇源猬裂頭蚴總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)目的片段進(jìn)行體外擴(kuò)增,并克隆入原核表達(dá)載體pE

2、T-28a(+),構(gòu)建pET-28a(+)-27kDa-CP重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Transetta(DE3)中,觀察在不同培養(yǎng)時(shí)間、不同濃度異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及不同培養(yǎng)溫度條件下27kDa-CP重組蛋白的表達(dá)情況。用鎳離子柱親和層析法純化目的蛋白,表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE及Western Blotting進(jìn)行分析。②用純化后的重組27kDa-CP蛋白免疫小鼠,制備多克隆抗體(一抗),用異硫氰酸熒光素(FITC

3、)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為二抗,對(duì)27kDa-CP在猬迭宮絳蟲成蟲、裂頭蚴組織中的位置分布進(jìn)行免疫熒光定位。
  結(jié)果:
 ?、賞ET-28a(+)-27kDa-CP重組質(zhì)粒經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后,蛋白在大腸埃希菌 Transetta(DE3)中成功表達(dá),最適表達(dá)條件為:培養(yǎng)溫度30℃,IPTG濃度為0.3mmol/L,培養(yǎng)時(shí)間為18h。重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá),純化后測得其濃度為0.2 mg/mL。②純化后的重組蛋白經(jīng)We

4、stern Blotting檢測,其相對(duì)分子質(zhì)量大?。∕r)約為35kDa,與預(yù)期大小相符,且能被重組蛋白免疫小鼠血清識(shí)別。③免疫熒光定位顯示27kDa-CP在裂頭蚴皮層及排泄管中呈高度表達(dá);在成蟲中,以節(jié)片(孕節(jié)和成節(jié))子宮內(nèi)蟲卵卵殼的表達(dá)最強(qiáng),其次為排泄管道及皮層。
  結(jié)論:
 ?、俪晒?gòu)建了猬迭宮絳蟲27kDa-CP基因原核表達(dá)體系,通過表達(dá)條件的優(yōu)化,在大腸埃希菌Transetta(DE3)中27kDa-CP重組蛋

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