葉酸殼聚糖川芎嗪納米粒體外抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用研究.pdf

1、目的:
　　探討葉酸殼聚糖川芎嗪納米粒體外抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　1.葉酸殼聚糖川芎嗪納米粒（主動(dòng)靶向納米粒，F(xiàn)A-CS-LZ-NPs）的制備。采用離子交聯(lián)法制備葉酸殼聚糖川芎嗪納米粒，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。包封率、載藥量檢測(cè)采用高效液相色譜法，用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)并采用激光粒度分析儀進(jìn)行粒徑檢測(cè)。
　　2.MTT法檢測(cè)FA-CS-LZ-NPs的細(xì)胞毒性，確定給藥劑量。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人宮頸

2、癌Hela細(xì)胞和人肺腺癌A549細(xì)胞，將不同給藥濃度(2、1、0.5、0.25、0.05、0.025、0.01mg·mL-1)的FA-CS-LZ-NPs和空納米粒分別作用于以上兩種細(xì)胞。計(jì)算7個(gè)給藥濃度下細(xì)胞存活率，設(shè)定細(xì)胞存活率為95％的藥物濃度為給藥劑量。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組與給藥方案
　　實(shí)驗(yàn)組:給予主動(dòng)靶向納米粒;
　　對(duì)照組:分別給予殼聚糖川芎嗪納米粒（被動(dòng)靶向納米粒，CS-LZ-NPs）、川芎嗪溶液(ligu

3、strazine，LZ)、空納米粒;
　　空白對(duì)照組:僅給予空白培養(yǎng)基。
　　4.抑制腫瘤細(xì)胞侵襲作用研究:采用Tanswell小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察主動(dòng)靶向納米粒抑制腫瘤細(xì)胞侵襲作用。每個(gè)小室（預(yù)鋪Matrigel膠）上方分別加入含牛血清白蛋白(BSA)，不含胎牛血清(FBS)的Hela和A549細(xì)胞混懸液，小室下方加入含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液，按3項(xiàng)下方法進(jìn)行分組給藥。作用24 h后，移出小室，用棉簽擦去小室上方細(xì)胞，多聚甲醛

4、固定，結(jié)晶紫染色，PBS沖洗，顯微鏡拍照(200×)，比較各組侵襲細(xì)胞數(shù)量。
　　5.MMP-9與VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè):采用western blot法檢測(cè)MMP-9與VEGF蛋白表達(dá)情況。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela和A549細(xì)胞進(jìn)行分組給藥，實(shí)驗(yàn)組給予主動(dòng)靶向納米粒，對(duì)照組分別給予被動(dòng)靶向納米粒和川芎嗪溶液，空白對(duì)照組僅給予空白培養(yǎng)基，24h后，進(jìn)行各給藥組細(xì)胞的總蛋白提取，經(jīng)過(guò)電泳分離，轉(zhuǎn)膜和抗體孵育等步驟后進(jìn)行用脫脂奶粉封閉，發(fā)光試

5、劑顯影，置于暗匣顯影于膠片，定影，拍照，灰度分析軟件檢測(cè)細(xì)胞中MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)情況，并以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算MMP-9與VEGF蛋白表達(dá)水平。
　　6.MMP-9與VEGF基因表達(dá)檢測(cè):采用Realtime-PCR法檢測(cè)MMP-9與VEGF基因表達(dá)情況。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela和A549細(xì)胞進(jìn)行分組給藥，實(shí)驗(yàn)組給予主動(dòng)靶向納米粒，對(duì)照組分別給予被動(dòng)靶向納米粒和川芎嗪溶液，空白對(duì)照組僅給予空白培養(yǎng)基，給藥24 h后，

6、各給藥組進(jìn)行總RNA的提取，加入引物后反轉(zhuǎn)錄目標(biāo)RNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR法計(jì)算MMP-9與VEGF基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.FA-CS-LZ-NPs的制備
　　制備的FA-CS-LZ-NPs粒徑為133.9±4.1nm，包封率為38.61±0.79％，載藥量為9.65±0.20％，分散度(PDI)為0.249±0.0030，納米粒分散性好，成圓球形。
　　2.FA-CS-LZ-NPs細(xì)胞毒性
　

7、　FA-CS-LZ-NPs對(duì)Hela細(xì)胞的無(wú)毒劑量為相當(dāng)于川芎嗪濃度42.40μg·mL-1，該濃度下A549細(xì)胞的生長(zhǎng)率為97.13％?？瞻准{米粒在給藥濃度范圍內(nèi)對(duì)2種細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。
　　3.抑制腫瘤細(xì)胞侵襲
　　Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，主、被動(dòng)靶向納米粒和溶液組均能顯著抑制Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞的侵襲作用。然而，對(duì)于葉酸受體高表達(dá)的Hela細(xì)胞，主動(dòng)納米粒組遷移的細(xì)胞數(shù)顯著低于被動(dòng)靶向納米粒組和溶液組，具有

8、顯著性差異，而對(duì)A549細(xì)胞則不存在顯著性差異。
　　4.對(duì)MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)的影響。
　　Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，主、被動(dòng)靶向納米粒和溶液組均能顯著抑制Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞MMP-9酶的表達(dá)，對(duì)于葉酸受體高表達(dá)的Hela細(xì)胞，主動(dòng)靶向納米粒組MMP-9酶的表達(dá)顯著低于被動(dòng)靶向納米粒組和溶液組，其具有顯著性差異，而A549細(xì)胞則不存在顯著性差異。對(duì)VEGF蛋白的檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白

9、對(duì)照組比較，主、被動(dòng)靶向納米粒和溶液組均能顯著抑制Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)，對(duì)于葉酸受體高表達(dá)的Hela細(xì)胞，主動(dòng)靶向納米粒組VEGF蛋白的表達(dá)顯著低于溶液組，但與被動(dòng)靶向納米粒組比較，差異無(wú)顯著性。A549細(xì)胞經(jīng)各給藥組處理后，主、被動(dòng)靶向納米粒和溶液組均能顯著抑制其VEGF蛋白的表達(dá)，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異，主動(dòng)靶向納米粒組VEGF蛋白的表達(dá)顯著低于溶液組，但與被動(dòng)靶向納米粒組比較，差異無(wú)顯著性。

10、　　5.對(duì)MMP-9和VEGF基因表達(dá)的影響。
　　Realtime-PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，主、被動(dòng)靶向納米粒和溶液組均能顯著抑制Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞MMP-9和VEGF基因的表達(dá)，并且，對(duì)于葉酸受體高表達(dá)的Hela細(xì)胞，主動(dòng)靶向納米粒組與被動(dòng)靶向納米粒組和溶液組比較均存在顯著性差異，而A549細(xì)胞主、被動(dòng)組之間不存在顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　與各對(duì)照組相比，F(xiàn)A-CS-LZ-NPs具有明顯抑制H