大鼠局灶性腦損傷后不同時(shí)程calpain1與calpain2的表達(dá)變化.pdf

1、目的： 腦損傷是法醫(yī)學(xué)鑒定工作中常見(jiàn)的損傷類型。腦損傷機(jī)制、形成時(shí)間和程度判斷一直受法醫(yī)學(xué)工作者重視，其中腦損傷形成時(shí)間推斷對(duì)刑事案件偵查具有重要意義，然而準(zhǔn)確地推斷腦損傷時(shí)間一直是法醫(yī)學(xué)鑒定中的難題。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Western blot方法檢測(cè)大鼠局灶性腦損傷后鈣激活中性蛋白酶1和2(calpain1和calpain2)表達(dá)情況，研究calpain1和calpain2在腦損傷修復(fù)過(guò)程中所起的作用，并對(duì)

2、calpain1和calpain2表達(dá)變化的時(shí)間規(guī)律在推斷腦損傷形成時(shí)間方面的應(yīng)用性進(jìn)行了探討。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 一、動(dòng)物模型的制作，分組與對(duì)照 雄性Sprague-Dawley大鼠50只，體重200～250g。隨機(jī)分為10組，每組5只，其中8組為實(shí)驗(yàn)組，1組為對(duì)照組，1組為假手術(shù)組。動(dòng)物模型采用本課題組研制的大鼠腦損傷分級(jí)自由落體打擊模型，造成大鼠局灶性腦損傷。大鼠稱重后，乙醚吸入預(yù)麻醉，2％戊巴比妥鈉(30

3、mg/kg)腹腔注射麻醉。正中切開(kāi)大鼠頂部頭皮，在人字縫前3mm、矢狀縫旁3mm處鉆直徑為5mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完好。采用自由落體打擊裝置，以30g重錘從25cm高處落下，打擊暴露的腦組織。分別于傷后15min、12h、24h、3d、5d、7d、10d和15d將大鼠麻醉后脫頸椎處死，取出整腦。以損傷灶為中心冠狀切開(kāi)，以備HE染色、免疫組化染色和Western blot檢測(cè)應(yīng)用。假手術(shù)組僅行顱骨鉆孔開(kāi)窗，未打擊。對(duì)照組及假手術(shù)組，以

4、同樣方法取相同部位的腦組織作為對(duì)照。 二、免疫組織化學(xué)染色 腦組織經(jīng)4％多聚甲醛/PBS pH7.4固定液固定后，水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作5μm厚度切片。采用鏈霉素-生物素法(SP法)進(jìn)行免疫組化染色，并用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，具體步驟同試劑盒說(shuō)明書(shū)。calpain1或calpain2抗體1:400稀釋，4℃孵育過(guò)夜。染色過(guò)程中另以PBS替代一抗，作為空白對(duì)照。兔抗大鼠calpain1多克隆抗體購(gòu)于Ab

5、cam公司，兔抗大鼠calpain2抗體購(gòu)于Sigma-Aldrich公司，SP免疫組織化學(xué)試劑盒與DAB顯色劑購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。 使用Motic Images Advanced3.2軟件對(duì)calpain1和calpain2免疫組化染色陽(yáng)性反應(yīng)物面積百分比及平均光密度值進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析。 三、Western blot檢測(cè) 提取腦組織蛋白并進(jìn)行蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)印，5％脫脂牛奶

6、封閉，一抗(1:1000稀釋)、二抗(1:2500稀釋)孵育后，DAB顯色。以GAPDH為內(nèi)參。應(yīng)用Fluorchem V2.0 Stand Alone軟件獲取感光條帶的平均灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 對(duì)照組及假手術(shù)組腦組織均有calpain1和calpain2陽(yáng)性表達(dá)。 大鼠局灶性腦損傷后，損傷周邊區(qū)calpain1表達(dá)：陽(yáng)性染色面積及強(qiáng)度于傷后逐漸增強(qiáng)，至傷后12h達(dá)

7、高峰，傷后24h陽(yáng)性染色逐漸減弱，傷后5d陽(yáng)性表達(dá)再次增強(qiáng)，達(dá)另一高峰，傷后7d、10d陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱，至15d接近對(duì)照組水平。 損傷周邊區(qū)calpain2表達(dá)：陽(yáng)性染色面積及強(qiáng)度于傷后逐漸增強(qiáng)，至傷后12h達(dá)高峰，傷后24h陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱，傷后5d表達(dá)再次增強(qiáng)，傷后7d、10d陽(yáng)性表達(dá)減弱，至15d陽(yáng)性表達(dá)接近對(duì)照組。 二、Western blot結(jié)果 以標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker做指示，calpain1在80

8、kDa和58kDa處顯示陽(yáng)性譜帶，calpain2在80kDa處顯示陽(yáng)性譜帶，GAPDH在36kDa處顯示陽(yáng)性譜帶。 Westem blot結(jié)果顯示大鼠局灶性腦損傷后calpain1和calpain2蛋白的感光條帶在濃度及寬度上存在變化，其平均灰度值的變化具有一定的時(shí)間規(guī)律性并與免疫組織化學(xué)的結(jié)果相一致。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)采用大鼠腦損傷分級(jí)自由落體打擊模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Western blot方法檢測(cè)大

9、鼠腦損傷后calpain1和calpain2表達(dá)情況，結(jié)果表明： 1、正常大鼠腦組織中calpain1和calpain2均有表達(dá)，大鼠局灶性腦損傷后，損傷周邊區(qū)calpain1和calpain2的表達(dá)隨時(shí)間而呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律，且呈較明顯的雙峰模式。 2、calpain1和calpain2的此種時(shí)間規(guī)律性變化可用于腦損傷形成時(shí)間的推斷。 3、calpain1和calpain2的此種時(shí)間規(guī)律性變化提示我們可以將ca