Wnt-β-catenin信號通路對肺腺癌A549細胞腫瘤干細胞特性作用研究.pdf

1、目的：不同濃度氯化鋰(LiCl)作用A549細胞或利用小干擾RNA(siRNA)技術干擾A549細胞β-catenin的表達從而激活或抑制Wnt/β-catenin信號通路，觀察細胞增殖、克隆形成、遷徙及耐藥能力等腫瘤干細胞特性的改變，并且觀察肺癌干細胞標記物OCT-4的表達變化，從而探討Wnt/β-catenin信號通路對肺腺癌A549細胞腫瘤干細胞特性的作用并初步探討其作用機制。
　　 方法：A549細胞經(jīng)不用濃度的LiCl

2、作用不同時間，選定最佳條件，觀察其對Wnt/β-catenin通路的激活作用；β-catenin干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞，觀察其對細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用；觀察指標：噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖能力、流式細胞術進行細胞周期分析、克隆形成實驗觀察細胞克隆形成率、Millicell小室遷徙實驗測定細胞的遷徙能力、藥物敏感實驗觀察細胞耐藥能力的改變、實時(real time)PCR法及western blot蛋白印

3、跡法檢測干細胞標記OCT-4基因及蛋白水平表達的改變，研究Wnt/β-catenin信號通路激活與抑制對上述指標的作用。
　　 結果：經(jīng)預試驗確定LiCl的最佳作用濃度為10mmol/L，最佳作用時間為24h。A549細胞經(jīng)10mmol/LLiCl作用24h后，與對照組相比，蛋白印跡實驗結果顯示β-catenin的蛋白水平表達增加(1.240±1.220vs0.987±0.903，P＜0.05)，免疫組化顯示β-catenin的

4、表達出現(xiàn)胞漿內(nèi)積聚及向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，realtimePCR結果發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路的靶基因cyclinD1表達上調(diào)(0.023±0.006vs0.007±0.003，P＜0.05)，Wnt/β-catenin信號通路激活；Wnt/β-catenin信號通路激活后，A549細胞的增殖能力增強，增殖率為32.24％，G0-G1期細胞明顯減少[(63.3±3.205)％vs(79.81±1.5)％，P＜0.01]，S期細

5、胞增多[(32.866±3.631)％vs(19.513±2.508)％，P＜0.01]，克隆形成率增加[(22.875±2.115)％vs(11.455±4.274)％，P＜0.01]，穿過Millicell小室底膜的細胞數(shù)明顯增多(52.5±4.041vs27.250±2.500，P＜0.01)，對順鉑的耐藥能力在所檢測藥物濃度均有不同程度的增強，OCT-4基因(0.073±0.012vs0.017±0.006，P＜0.01)及蛋白

6、(0.920±0.182vs0.335±0.064，P＜0.01)表達水平均上調(diào)；β-catenin干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞后，real timePCR結果發(fā)現(xiàn)β-cateninmRNA表達明顯下降(0.002±0.001vs0.023±0.002，P＜0.01)，同時Wnt/β-catenin信號通路的靶基因cyclinDlmRNA表達下調(diào)(0.005±0.002vs0.042±0.004，P＜0.05)，此信號通路被抑制：Wnt/β

7、-catenin信號通路抑制后，細胞的增殖能力降低，增殖抑制率為20.29％，G0-G1期細胞明顯增多[（86.釷2.6）％vs（73.8±0.9）％，P＜0.01]，S期及G2-M期細胞減少，克隆形成率降低[（31.6±7.7）％vs（46.9±7.3）％，P＜0.05]，穿過Millicell小室底膜的細胞數(shù)明顯減少(16.0±3.8vs32.7±3.1，P＜0.01)，對順鉑的耐藥能力降低，OCT-4基因[(0.016±0.011

8、)vs(0.043±0.032),P＜0.05]及蛋白[(0.28±0.078)vs(0.555±0.088),P＜0.05]表達水平均下調(diào)。
　　 結論：A549細胞經(jīng)10mmol/LLiCl作用24h，可激活細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路；Wnt/β-catenin信號通路的激活可促進A549細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換，從而促進細胞增殖，同時克隆形成、遷徙及耐藥能力等腫瘤干細胞特性增強，肺癌干細胞標記OCT-4的基因及

9、蛋白表達均增加；β-catenin干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞可抑制細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號傳導途徑；Wnt/β-catenin信號通路的抑制可使細胞發(fā)生G0-G1期阻滯，抑制細胞增長，同時克隆形成、遷徙及耐藥等腫瘤干細胞特性受抑制，肺癌干細胞標記物OCT-4的基因及蛋白表達均降低。以Wnt/β-catenin信號傳導途徑為靶點，抑制此通路在肺腺癌中的活化及其靶基因的表達，可能成為肺癌分子靶向治療并有可能是針對肺癌干細胞治療的新