四環(huán)素誘導大鼠靶向PPARγ基因沉默治療糖皮質激素性骨質疏松癥的實驗研究.pdf

1、第一部分、構建大鼠PPARγ基因的tet-on慢病毒載體，體外實驗確定載體對大鼠BMSCs成脂與成骨分化的影響
　　目的:分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs。構建大鼠PPARγ基因shRNA的Tet-on慢病毒載體，并轉染大鼠BMSCs，在四環(huán)素的誘導下確定其沉默效應及對大鼠BMSCs成脂與成骨分化的影響。
　　方法:采用貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，SABC法進行鑒定。針對大鼠PPARγ基因特異序列，通過質粒重組、病毒包裝及測序驗證

2、，構建pTRIPZ/PPARγ-shRNA慢病毒載體，設空白對照組（Control組）、非特異性質粒轉染組（shNTC）、慢病毒質粒轉染組（shPPARγ）。分別轉染大鼠BMSCs后，在四環(huán)素誘導下確定其沉默效應及最佳四環(huán)素誘導濃度。成脂誘導后RT-PCR檢測成脂基因C/EBP?、ADD1 mRNA的表達，Western blotting檢測C/EBP?、ADD1蛋白的表達，油紅O染色檢測其成脂細胞分化。成骨誘導后RT-PCR檢測成骨基

3、因collagen I和 Cbfa1/Runx2的表達，Western blotting檢測collagen I和 Cbfa1/Runx2蛋白的表達，通過茜素紅染色、鈣含量分析及ALP活性測定檢測成骨細胞分化。
　　結果:通過貼壁法可獲得較純化的大鼠BMSCs，SABC法鑒定細胞表面表達CD44，CD54，CD71，不表達CD34，CD45。構建針對大鼠PPARγ基因的四環(huán)素誘導慢病毒載體pTRIPZ/PPARγ-shRNA測序結

4、果與設計的序列相符合，滴度為3.6×10E8 TU/ml，轉染大鼠BMSCs后可表達紅色熒光蛋白，轉染效率70％以上。在20μg/ml的四環(huán)素誘導下可達到92%的沉默效果。成脂誘導后shPPARγ組相對于Control組ADD1、 C/EBPαmRNA及蛋白表達明顯降低（P＜0.01），shNTC組與Control組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），成脂誘導2w后各組細胞油紅O染色結果，shPPARγ組細胞脂滴聚集明顯減少，成脂分化

5、明顯受阻。各組細胞成骨誘導培養(yǎng)后，shPPARγ組相對于Control組collagen I、Cbfa1/Runx2 mRNA及蛋白表達明顯上調（P＜0.05），而shNTC組與Control組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。成骨誘導2w后各組細胞茜素紅染色結果，shPPARγ組細胞紅色鈣結節(jié)大量聚集，成骨分化明顯增強，鈣含量測定結果，shPPARγ組細胞明顯高于Control組及shNTC組，成骨誘導2w后各組細胞ALP活性測定，s

6、hPPARγ組細胞明顯高于Control組及shNTC組, shNTC組與Control組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結論:成功構建大鼠pTRIPZ/PPARγ-shRNA慢病毒載體，轉染大鼠BMSCs后，在四環(huán)素誘導下可獲得穩(wěn)定的沉默效應。體外實驗對大鼠BMSCs有抑制成脂、促進成骨的作用。
　　第二部分、四環(huán)素在大鼠股骨中的代謝動力學研究
　　目的:探討四環(huán)素在大鼠股骨骨組織及骨髓組織的代謝規(guī)律。<

7、br>　　方法:36只大鼠隨機分為12組，一個對照組及11個時間點組，對照組給予生理鹽水灌胃，其余大鼠采用四環(huán)素灌胃。分別在不同時間點取股骨骨組織及骨髓組織采用蛋白沉淀法提取樣本，以甲硝唑為內標，采用高效液相色譜串聯質譜法測定每個樣本中四環(huán)素含量，繪制時間-濃度曲線。取各個時間點的大鼠股骨，經過NaOH溶液處理后，在熒光顯微鏡下觀察其熒光強度，并繪制時間-熒光信號強度曲線。
　　結果:通過高效液相色譜串聯質譜法在股骨及骨髓中檢測出

8、四環(huán)素藥物峰，并繪制標準曲線，定量限2.5μg/kg，精密度、回收率均符合檢測要求。根據測量的各個時間點的四環(huán)素量，在股骨骨組織灌胃后48-72h四環(huán)素可達最高峰，以后不再增加。在骨髓組織中灌胃后12h達到最高峰濃度，以后濃度逐漸減小。熒光顯微鏡觀察72h后熒光強度最高，以后不再增加。
　　結論:四環(huán)素在大鼠股骨骨組織中48-72h即可達到最大濃度，并趨于穩(wěn)定。在骨髓組織中12h達到峰濃度，以后濃度逐漸減小。
　　第三部分、

9、四環(huán)素誘導靶向pTRIPZ/PPARγ-shRNA慢病毒載體對GIOP大鼠的治療效果
　　目的:建立大鼠GIOP模型，研究四環(huán)素誘導靶向pTRIPZ/PPARγ-shRNA慢病毒載體對GIOP大鼠的治療作用。
　　方法:32只SD雄性大鼠隨機分為4組，每組8只。對照組（Control組）給予皮下注射生理鹽水5mg/kg/d，每周5次；激素組（Met組）皮下注射甲強龍5 mg/kg/d，每周5次，建立GIOP模型；四環(huán)素灌胃組

10、（Tet組）：在Met組基礎上給予四環(huán)素100 mg/kg/d灌胃，每周兩次；基因治療組（shPPARγ組）：在Met基礎上給予給予四環(huán)素100 mg/kg/d灌胃，12h后向股骨骨髓腔內注射TRIPZ/PPARγ-shRNA慢病毒顆粒，每周兩次。8周后測量各組大鼠體重、血清生化指標及股骨和L3椎體骨密度，制作骨切片，Micro-CT、HE染色觀察骨顯微結構變化，比較各組大鼠骨形態(tài)計量學指標及骨生物力學參數。
　　結果:
　

11、?。?）體重方面：實驗前各組大鼠體重無明顯差異（P＞0.05），8周后Met組低于Control組（P＜0.01）；Tet組與Met組差異不明顯（P＞0.05）；shPPARγ組明顯高于Met組（P＜0.01）；
　?。?）血生化指標：Met組總膽固醇、血清Ca明顯高于Control組（P＜0.01），血清ALP明顯低于Control組（P＜0.01）；Tet組血鈣明顯低于Met組（P＜0.01），總膽固醇、血清ALP與Met組無

12、明顯差異（P＞0.05）；shPPARγ組總膽固醇、血清Ca明顯低于Met組（P＜0.05），血清ALP明顯高于Met組（P＜0.05）；Met組、Tet組及shPPARγ組血磷均低于Control組（P＜0.05），但三者之間無明顯差異（P＞0.05）。
　?。?）股骨及L3椎體骨密度測定：Met組明顯低于Control組（P＜0.01）；Tet組、shPPARγ組骨密度較Met組明顯升高（P＜0.05）；且shPPARγ組明顯

13、高于Tet組（P＜0.05）。
　?。?）Micro CT分析：Met組與Control組比較骨小梁稀疏，測得骨密度顯著降低（P＜0.01）；Tet組與Met組比較股骨骨小梁無明顯變化（P＞0.05），但腰椎骨小梁增多，骨密度增加（P＜0.01）；shPPARγ組與Met組、Tet組比較，骨小梁增多，測得骨密度明顯升高（P＜0.01）。
　?。?）HE染色：Met組與Control組比較，骨小梁中的骨細胞數目減少，絕大部分細

14、胞排列雜亂，網狀連接破壞；Tet組較Met組骨小梁數目有增多，部分結構變得整齊；shPPARγ組與Met組比較，骨小梁排列明顯緊密、有序，骨小梁數目明顯增多，網狀結構基本恢復。
　?。?）骨形態(tài)計量學分析：Met組%Tb.Ar、Tb.N、Tb.Th均較Control組下降，而Tb.Sp指標較Control組上升（P＜0.01）；Tet組%Tb.Ar、Tb.N較Met組升高，Tb.Sp降低（P＜0.05），但Tb.Th與Met組無明

15、顯差異（P＞0.05）；shPPARγ組%Tb.Ar、Tb.N、Tb.Th指標均較Met組上升，Tb.Sp降低（P＜0.01）；且shPPARγ組與Tet組比較所有指標均有顯著性差異（P＜0.05）。
　　（7）骨生物力學分析：Met組較Control組最大載荷、最大擾度、最大應力明顯降低（P＜0.01）；Tet組與Met組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；shPPARγ組三項指標均高于Met組、Tet組（P＜0.05）