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文檔簡介
1、目的:糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(GIOP)是一種由于內(nèi)源性或者外源性糖皮質(zhì)激素所致的,以骨強(qiáng)度下降、骨折風(fēng)險增加為特點(diǎn)的代謝性骨病,是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的重要類型之一。糖皮質(zhì)激素(GC)作為一種由腎上腺所分泌的甾體類激素,對機(jī)體既發(fā)揮重要的生理性調(diào)節(jié)作用,又作為一種重要的抗炎藥物,廣泛應(yīng)用于臨床,參與到許多疾病的治療中。長期應(yīng)用GC所可能產(chǎn)生的副作用,GIOP便是其中之一,其危害性也較為顯著,包括嚴(yán)重的骨痛、關(guān)節(jié)面塌陷、意外骨折、股骨頭壞死
2、、關(guān)節(jié)炎等。長期應(yīng)用GC治療原發(fā)病的患者,同時需要接受抗骨質(zhì)疏松的治療,目前已經(jīng)成為國際共識。但是現(xiàn)有的抗骨吸收類藥物、促骨形成類藥物等的治療結(jié)果往往差強(qiáng)人意。在面對這類患者時,醫(yī)生可采用的治療手段相對有限,并無有效治愈的辦法。
人參作為一種中草藥,已被許多國家認(rèn)可并廣泛使用。人參皂苷(GS)是人參中可以發(fā)揮重要生理功能的主要活性成分,具有類似于甾體類激素樣的結(jié)構(gòu),攝入后可廣泛作用于機(jī)體的各器官組織系統(tǒng),具備抗炎、抗應(yīng)激、抗氧
3、化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多重治療功效。迄今,人們已從人參植物體中分離出來多達(dá)100余種皂苷類單體成分,某些如Rb1、Rb2、Rd等單體還可以在特定條件下,轉(zhuǎn)化為20(S)-Rg3或20(R)-Rg3的立體異構(gòu)體。GS Rg3(C42H72O13)也被認(rèn)為是最有生理活性的皂苷單體成分。已有學(xué)者報道Rg3具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和保護(hù)神經(jīng)的作用。近期也有研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵后的紅參中GS Rg3的含量顯著升高,此種提取物可顯著增強(qiáng)MC3T3-E1細(xì)
4、胞的成骨分化。推測Rg3可能在這種增強(qiáng)作用中起主要作用。不久,該團(tuán)隊(duì)還證明了Rg3同樣具有抑制RAW264.7細(xì)胞破骨向分化的作用。盡管Rg3既可以促進(jìn)成骨分化,又能抑制破骨作用,但是其對骨質(zhì)疏松癥尤其是GIOP是否有治療效果,國際上尚未見明確報道,其可能的作用機(jī)制還不清楚。
本課題將應(yīng)用地塞米松(DXM)對SD大鼠進(jìn)行造模,進(jìn)行相關(guān)的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究,重點(diǎn)討論GS Rg3是否對GIOP具有治療作用,同時進(jìn)一步闡釋藥物的具體
5、信號通路,為運(yùn)動醫(yī)學(xué)關(guān)節(jié)外科乃至其他臨床各科室治療骨質(zhì)疏松癥時提供新的可供選擇的藥物。
研究方法:本研究選取SD大鼠并提取其成骨細(xì)胞,通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)兩部分,共同完成本課題研究。所有的大鼠實(shí)驗(yàn)均經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會所批準(zhǔn)。
1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分:選取SPF級雌性SD大鼠(5月齡)48只,隨機(jī)分成6組(A組:對照組,B組:20 mg/kg GS Rg3,C組:DXM,D組:DXM+10 mg/kg GSRg3,E
6、組:DXM+20 mg/kg GS Rg3,F(xiàn)組:DXM+20μg/kg阿侖膦酸),每組8只大鼠。除A組(對照組)和B組(20 mg/kg GS Rg3)外,其余各實(shí)驗(yàn)組利用DXM連續(xù)5周行皮下注射,對大鼠進(jìn)行GIOP造模并取得成功。不同組間的大鼠在飼養(yǎng)時每日灌胃入10 mg/kg或20 mg/kg的GS Rg3藥物。選用如今臨床一線抗骨質(zhì)疏松藥物阿侖膦酸鈉皮下注射作為陽性對照組,參與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較。在動物建模前和處死前,分別檢測大鼠的
7、體重變化和骨礦物質(zhì)密度(BMD)變化,采集外周血并分離血清,應(yīng)用ELISA法對b-ALP和TRACP-5b進(jìn)行檢測。處死所有大鼠后,取左側(cè)股骨碾碎裂解提取骨組織蛋白用于RANKL和OPG的檢測(Western-Blot),取右側(cè)股骨固定脫鈣后用于HE染色觀察成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的數(shù)量和分布情況。
2、體外實(shí)驗(yàn)部分:通過分離新出生24 h內(nèi)SD大鼠的顱骨,提取到原代成骨細(xì)胞,選擇傳至3~7代的細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)研究。分別用不同濃度的D
8、XM(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM)和Rg3(1μM、10μM、20μM、50μM、100μM)處理成骨細(xì)胞48 h,并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、CCK-8法檢測細(xì)胞活性和ALP檢測細(xì)胞成骨活性,探摸最佳的藥物濃度。進(jìn)而選擇可引起成骨細(xì)胞明顯凋亡的最小濃度DXM,和對細(xì)胞活性無明顯影響的最大濃度Rg3,探尋Rg3對DXM介導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制和凋亡的拮抗作用。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入DXM和Rg3,共同誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖和分
9、化。經(jīng)茜素紅染色、ELISA檢測b-ALP的表達(dá)、Real-time PCR和Western-Blot檢測RANKL和OPG的表達(dá),來進(jìn)一步確認(rèn)GS Rg3可改善經(jīng)DXM處理后的細(xì)胞的活性和成骨能力。加入BMP信號通路抑制劑Noggin后,通過Western-Blot方法對通路上BMP-2、BMPR1A和Runx2蛋白的檢測,確定GS Rg3作用的具體信號通路。
結(jié)果:動物造模過程順利,并且所有實(shí)驗(yàn)大鼠在實(shí)驗(yàn)所需的5周時間內(nèi)均
10、存活,處死前一般狀態(tài)可。
1、GS Rg3對DXM介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡存在抑制作用。
2、GS Rg3可以逆轉(zhuǎn)DXM對細(xì)胞成骨活性抑制的作用。
3、GS Rg3可以緩解GIOP大鼠體重的下降,并增強(qiáng)GIOP大鼠的骨密度。
4、GS Rg3可以有效增強(qiáng)骨組織內(nèi)b-ALP的表達(dá),同時減弱TRACP-5b的表達(dá)。
5、GS gg3可以增加GIOP大鼠的股骨中骨細(xì)胞的數(shù)量,降低單位面積內(nèi)破骨細(xì)胞的數(shù)量
11、。
6、GS Rg3可以顯著抑制RANKL的表達(dá),同時增加OPG的表達(dá)。
7、GS Rg3可以增加成骨細(xì)胞的鈣鹽沉積量和細(xì)胞內(nèi)b-ALP的表達(dá)。
8、抑制劑Noggin可以抵消GS Rg3對RANKL表達(dá)的抑制,同時抵消GS Rg3增加OPG表達(dá)的作用。
9、GS Rg3通過調(diào)節(jié)BMP-2/BMPR1A/Runx2信號通路減輕了DXM對成骨細(xì)胞的抑制作用。
結(jié)論:通過我們的研究證實(shí),GS
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