體外誘導(dǎo)胚胎干細胞分化為甲狀腺細胞的實驗研究——貼壁誘導(dǎo)及三維立體結(jié)構(gòu)誘導(dǎo).pdf

1、胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)來源于發(fā)育分化早期囊胚的內(nèi)細胞團，適當條件下能在體外維持未分化狀態(tài)、正常二倍體核型及無限增殖能力，且具有多向分化潛能，能夠發(fā)育分化成機體三個胚層的所有類型細胞。ESCs已被廣泛用于細胞、組織和器官的修復(fù)和移植、發(fā)育生物學、克隆動物制作、動物醫(yī)學模型建立、基因功能研究、藥物篩選以及細胞分化機制的探索等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。 目前利用ESCs已經(jīng)在體外成功的誘導(dǎo)分化

2、為起源于三個胚層的多種細胞，其中神經(jīng)元細胞、肝細胞、胰島細胞、心肌細胞的誘導(dǎo)分化研究較多，相關(guān)技術(shù)較為成熟，已用于臨床的替代治療，取得令人鼓舞的成果。 隨著加碘鹽的普及，以及飲食習慣和生活節(jié)奏的變化，我國甲狀腺功能亢進癥(簡稱甲亢)的發(fā)病率逐年升高。在藥物、手術(shù)、放射性<'131>Ⅰ三種甲亢治療方法中，<'131>Ⅰ治療甲亢以其療效確切、治愈率高以及費用低，副反應(yīng)少被越來越多的甲亢患者和臨床醫(yī)生認可。但<'131>Ⅰ治療甲亢的最

3、大不足是治愈后有部分病人會出現(xiàn)甲狀腺功能減低(簡稱甲減)，尤其是治療后最初10年內(nèi)永久性甲減發(fā)生率以每年2﹪～5﹪的比例增加，這種副作用嚴重影響了<'131>Ⅰ治療甲亢的發(fā)展和深入。甲減是一種嚴重影響生存質(zhì)量的疾病，其主要的治療方法是服用甲狀腺素替代治療；雖然絕大多數(shù)病人服用甲狀腺素后可正常生活，但病人難以接受終生服用甲狀腺素的現(xiàn)實；另外，有少量病人對甲狀腺素的替代用量很敏感，難以控制最佳劑量；而部分冠心病病人不適用甚至忌用甲狀腺素。因

4、此有必要探求新的治療甲減的可行辦法，ESCs的多向發(fā)育潛能為甲減治療帶來了潛在希望。研究目的1、探討體外誘導(dǎo)ESCs分化為甲狀腺細胞的可行性和相關(guān)調(diào)節(jié)因子； 2、除了從基因水平，分子水平定性誘導(dǎo)細胞中存在甲狀腺細胞的基礎(chǔ)上，進一步研究誘導(dǎo)甲狀腺細胞的分泌功能； 3、在貼壁誘導(dǎo)ESCs分化為甲狀腺細胞可行的基礎(chǔ)上，利用鼠尾膠原構(gòu)建三維立體結(jié)構(gòu)，探討三維結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)ESCs分化為甲狀腺細胞的可行性及潛在的濾泡功能重建優(yōu)勢。

5、 實驗方法 該實驗分兩部分：貼壁誘導(dǎo)和三維立體結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)。在貼壁誘導(dǎo)中，優(yōu)化ESCs的體外培養(yǎng)條件，取生長狀況良好、未分化的E14小鼠ESCs，先將其懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)育為擬胚體(：Embryoid bodies,EBs)，再繼續(xù)貼壁誘導(dǎo)EBs分化，在誘導(dǎo)期的不同階段，添加TSH、KI、Insulin作為誘導(dǎo)因子。倒置顯微鏡下觀察細胞分化過程中的形態(tài)學變化，RT-PCR法檢測誘導(dǎo)細胞中甲狀腺細胞特異性基因TSHR、NIS、TPO、T

6、g等的表達情況，激光共聚焦顯微鏡雙色熒光檢測PAX8和TTF1的共表達情況(PAX8和TTF1的共表達只出現(xiàn)在甲狀腺細胞前體及成熟甲狀腺細胞中)，電子顯微鏡觀察誘導(dǎo)細胞的超微結(jié)構(gòu)，尋找內(nèi)分泌類似細胞及可能存在的內(nèi)分泌顆粒。 在鼠尾膠原三維誘導(dǎo)中，利用鼠尾跟腱自制鼠尾膠原，構(gòu)建立體結(jié)構(gòu)；篩選生長狀況良好、未分化的ESCs，先將其懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)育為擬胚體(Embryoidbodies．EBs)，接種EBs于鼠尾膠原繼續(xù)誘導(dǎo)，誘導(dǎo)過程

7、中所添加的誘導(dǎo)因子及添加時程同貼壁誘導(dǎo)；倒置顯微鏡觀察細胞分化過程中的形態(tài)學變化，電子顯微鏡觀察可能存在的濾泡樣結(jié)構(gòu)及誘導(dǎo)細胞的超微結(jié)構(gòu)，尋找內(nèi)分泌顆粒。實驗結(jié)果ESCs在小鼠胚胎成纖維細胞構(gòu)建的滋養(yǎng)層上生長狀況良好，保持未分化狀態(tài)；脫滋養(yǎng)層后在重組小鼠白血病抑制因子(rmLIF)存在的條件下繼續(xù)保持未分化狀態(tài)。撤去rmLIF后很快發(fā)育為擬胚體并繼續(xù)分化。RT-PCR結(jié)果示，在誘導(dǎo)分化的第8天及第10天，誘導(dǎo)細胞可檢測到甲狀腺細胞分化特

8、有基因TSHR、Tg、TPO、NIS等的表達；雙色免疫熒光結(jié)果示，部分誘導(dǎo)細胞同時表達PAX8和TTF1，甲狀腺細胞分化率約2﹪～3﹪；電鏡下觀察誘導(dǎo)細胞的超微結(jié)構(gòu)示，部分細胞可見微絨毛，胞質(zhì)內(nèi)高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富，未見到顆粒樣物質(zhì)。三維誘導(dǎo)中，擬胚體不易貼壁，誘導(dǎo)細胞向四周爬開的速度較慢，分化細胞漸陷入鼠尾膠原：電鏡可見部分細胞呈抱團狀生長，微絨毛、高爾基、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞質(zhì)內(nèi)可見均質(zhì)的、膜包被的、稍低電子密度的顆粒樣物質(zhì)。

9、結(jié)論 胚胎干細胞經(jīng)過擬胚體階段，在一定培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)因子作用下，可定向分化為甲狀腺細胞。兩種誘導(dǎo)方法中均見部分誘導(dǎo)細胞的高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富，具備合成、分泌的功能，在三維誘導(dǎo)中，細胞胞質(zhì)內(nèi)可見顆粒樣物質(zhì)。由于甲狀腺細胞的分泌功能除了需要較成熟的濾泡結(jié)構(gòu)外，還需要細胞外基質(zhì)及其它外界條件調(diào)節(jié)，體外的誘導(dǎo)環(huán)境相對簡單；另外，甲狀腺細胞的分化率相對較低；所以該研究雖證實了ESCs在一定條件下可體外分化為甲狀腺細胞，但距離甲狀腺功能減