誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為小腸上皮樣細(xì)胞及小腸內(nèi)定植的研究.pdf

1、小腸上皮細(xì)胞是哺乳動(dòng)物消化吸收的主要細(xì)胞，由于各種原因(放射損傷、化療等)引起的小腸上皮細(xì)胞形態(tài)改變和功能受損，可導(dǎo)致嚴(yán)重的消化不良；小腸切除后引起的短腸綜合征及Crohn's病等炎癥性腸病所致的小腸頑固性潰瘍嚴(yán)重的威脅著人類的健康，使患者的生存質(zhì)量顯著下降，是臨床上面臨的一個(gè)棘手的問題。以往的治療方法包括胃腸外營養(yǎng)、應(yīng)用生長激素和小腸移植等均有一定的療效，但由于費(fèi)用較高，病人的生活質(zhì)量低下，小腸移植存在的供體缺乏、免疫排斥等問題限制了

2、其應(yīng)用。長期以來人們一直在探索能否有一個(gè)新的途徑徹底解決這類疾病。 胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)是從早期胚囊的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(iliner cell mass，ICM)分離出來的一種多能細(xì)胞系，是一群未分化的細(xì)胞，可以在體外長期不斷增殖，自我更新，并保持多向分化潛能，可以分化為內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的幾乎所有類型的細(xì)胞，甚至構(gòu)建各種組織、器官。只要能找到一種使胚胎干細(xì)胞向著預(yù)想的方向進(jìn)行定向分化的方法，我們

3、就可以得到用于構(gòu)建組織工程器官的種子細(xì)胞，甚至直接移植到體內(nèi)對(duì)疾病實(shí)施治療，這為我們提供了一個(gè)全新的手段?，F(xiàn)在已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)胚胎干細(xì)胞可以在體外被定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、胰島細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞，但是體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向小腸上皮細(xì)胞的定向分化國內(nèi)外均未見報(bào)道。 本研究分三個(gè)部分，在第一部分中采用中性蛋白酶I和膠原酶Ⅺ消化19d胎鼠的小腸組織獲得小腸上皮細(xì)胞，以作為本課題的陽性對(duì)照細(xì)胞；同時(shí)，

4、通過胰酶的差異消化方法獲得了13.5d胎鼠的小腸間質(zhì)細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行了長期培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)上清液作為ESC的誘導(dǎo)液用于后續(xù)研究。第二部分著重對(duì)體外誘導(dǎo)小鼠：ESC向小腸上皮樣細(xì)胞定向分化進(jìn)行了觀察研究。在特定的體外環(huán)境下ESC可以分化為多種細(xì)胞，而在整個(gè)分化過程中細(xì)胞所處的微環(huán)境起著決定性的作用，因此用小腸間質(zhì)細(xì)胞的上清收集液模擬小腸上皮細(xì)胞發(fā)育的微環(huán)境，同時(shí)探討人工誘導(dǎo)的分化條件，對(duì)不同濃度梯度和不同的時(shí)間加入表皮細(xì)胞生長因子(Epid

5、ermal Growth Factor，EGF)和肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的誘導(dǎo)效果進(jìn)行了觀察，并對(duì)分化后的細(xì)胞進(jìn)行了檢測。在實(shí)驗(yàn)的第三部分中，首先通過X射線照射制作了小腸損傷小鼠的模型，并用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)轉(zhuǎn)染標(biāo)記定向誘導(dǎo)分化后的ESC，并通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，觀察其定植情況。研究目的： 本

6、研究以多向分化潛能為基礎(chǔ)，體外誘導(dǎo)ESC分化為小腸上皮樣細(xì)胞，分析小腸間質(zhì)細(xì)胞上清液和細(xì)胞因子EGF、HGF對(duì)誘導(dǎo)ESC向小腸上皮樣細(xì)胞分化的作用，從而探索更優(yōu)化的分化誘導(dǎo)體系，為構(gòu)建組織工程器官提供種子細(xì)胞；觀察誘導(dǎo)后的ESC在小鼠小腸內(nèi)定植的情況，為其下一步體內(nèi)移植治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 結(jié)論 1．應(yīng)用中性蛋白酶I和膠原酶Ⅺ消化的方法可獲得比較純化的上皮細(xì)胞，通過組織塊培養(yǎng)法及胰酶差異消化可獲得比較純化的小腸間質(zhì)細(xì)胞。

7、 2．小腸間質(zhì)細(xì)胞上清液對(duì)體外定向誘導(dǎo)ESC向小腸上皮樣細(xì)胞分化有比較明確的促進(jìn)作用。 3．表皮細(xì)胞生長因子(EGF)對(duì)體外定向誘導(dǎo)ESC分化為小腸上皮樣細(xì)胞有一定的促進(jìn)作用；肝細(xì)胞生長因子(HGF)對(duì)其無明顯誘導(dǎo)優(yōu)勢。 4．分化早期加入EGF更有利于誘導(dǎo)ESC向小腸上皮樣細(xì)胞的分化。 5． EGFP腺病毒載體可以轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)分化后的胚胎干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率可達(dá)20％。 6．經(jīng)誘導(dǎo)分化的ESC及隨機(jī)分化的ES