誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞分化為小腸上皮樣細胞及小腸內(nèi)定植的研究.pdf

1、小腸上皮細胞是哺乳動物消化吸收的主要細胞，由于各種原因(放射損傷、化療等)引起的小腸上皮細胞形態(tài)改變和功能受損，可導(dǎo)致嚴重的消化不良；小腸切除后引起的短腸綜合征及Crohn's病等炎癥性腸病所致的小腸頑固性潰瘍嚴重的威脅著人類的健康，使患者的生存質(zhì)量顯著下降，是臨床上面臨的一個棘手的問題。以往的治療方法包括胃腸外營養(yǎng)、應(yīng)用生長激素和小腸移植等均有一定的療效，但由于費用較高，病人的生活質(zhì)量低下，小腸移植存在的供體缺乏、免疫排斥等問題限制了

2、其應(yīng)用。長期以來人們一直在探索能否有一個新的途徑徹底解決這類疾病。 胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)是從早期胚囊的內(nèi)細胞團(iliner cell mass，ICM)分離出來的一種多能細胞系，是一群未分化的細胞，可以在體外長期不斷增殖，自我更新，并保持多向分化潛能，可以分化為內(nèi)、中、外三個胚層的幾乎所有類型的細胞，甚至構(gòu)建各種組織、器官。只要能找到一種使胚胎干細胞向著預(yù)想的方向進行定向分化的方法，我們

3、就可以得到用于構(gòu)建組織工程器官的種子細胞，甚至直接移植到體內(nèi)對疾病實施治療，這為我們提供了一個全新的手段?，F(xiàn)在已經(jīng)有實驗研究證實胚胎干細胞可以在體外被定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞、心肌細胞、造血細胞、肝臟細胞、胰島細胞、軟骨細胞等多種細胞，但是體外誘導(dǎo)胚胎干細胞向小腸上皮細胞的定向分化國內(nèi)外均未見報道。 本研究分三個部分，在第一部分中采用中性蛋白酶I和膠原酶Ⅺ消化19d胎鼠的小腸組織獲得小腸上皮細胞，以作為本課題的陽性對照細胞；同時，

4、通過胰酶的差異消化方法獲得了13.5d胎鼠的小腸間質(zhì)細胞，并對其進行了長期培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)上清液作為ESC的誘導(dǎo)液用于后續(xù)研究。第二部分著重對體外誘導(dǎo)小鼠：ESC向小腸上皮樣細胞定向分化進行了觀察研究。在特定的體外環(huán)境下ESC可以分化為多種細胞，而在整個分化過程中細胞所處的微環(huán)境起著決定性的作用，因此用小腸間質(zhì)細胞的上清收集液模擬小腸上皮細胞發(fā)育的微環(huán)境，同時探討人工誘導(dǎo)的分化條件，對不同濃度梯度和不同的時間加入表皮細胞生長因子(Epid

5、ermal Growth Factor，EGF)和肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的誘導(dǎo)效果進行了觀察，并對分化后的細胞進行了檢測。在實驗的第三部分中，首先通過X射線照射制作了小腸損傷小鼠的模型，并用增強型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)轉(zhuǎn)染標記定向誘導(dǎo)分化后的ESC，并通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，觀察其定植情況。研究目的： 本

6、研究以多向分化潛能為基礎(chǔ)，體外誘導(dǎo)ESC分化為小腸上皮樣細胞，分析小腸間質(zhì)細胞上清液和細胞因子EGF、HGF對誘導(dǎo)ESC向小腸上皮樣細胞分化的作用，從而探索更優(yōu)化的分化誘導(dǎo)體系，為構(gòu)建組織工程器官提供種子細胞；觀察誘導(dǎo)后的ESC在小鼠小腸內(nèi)定植的情況，為其下一步體內(nèi)移植治療奠定實驗基礎(chǔ)。 結(jié)論 1．應(yīng)用中性蛋白酶I和膠原酶Ⅺ消化的方法可獲得比較純化的上皮細胞，通過組織塊培養(yǎng)法及胰酶差異消化可獲得比較純化的小腸間質(zhì)細胞。

7、 2．小腸間質(zhì)細胞上清液對體外定向誘導(dǎo)ESC向小腸上皮樣細胞分化有比較明確的促進作用。 3．表皮細胞生長因子(EGF)對體外定向誘導(dǎo)ESC分化為小腸上皮樣細胞有一定的促進作用；肝細胞生長因子(HGF)對其無明顯誘導(dǎo)優(yōu)勢。 4．分化早期加入EGF更有利于誘導(dǎo)ESC向小腸上皮樣細胞的分化。 5． EGFP腺病毒載體可以轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)分化后的胚胎干細胞，轉(zhuǎn)染率可達20％。 6．經(jīng)誘導(dǎo)分化的ESC及隨機分化的ES