大腸桿菌K12 GlcNAc-1-P尿苷轉(zhuǎn)移酶的研究.pdf

1、以寡糖和糖復(fù)合物(糖脂、糖蛋白等)形式存在的糖類化合物是發(fā)現(xiàn)于所有生命體的重要生物聚合物，它們在眾多復(fù)雜生物過程中發(fā)揮著不可替代的重要作用。糖鏈結(jié)構(gòu)形式的特定改變與特定的病理狀態(tài)(如癌癥和炎癥)機密相關(guān)，這顯示了糖鏈在臨床診斷中的應(yīng)用潛力，以及作為藥物開發(fā)靶點的可能性。
　　 自然界中糖鏈的生物合成是由糖基轉(zhuǎn)移酶催化進行的，它們將相應(yīng)的糖核苷酸上特定的單糖轉(zhuǎn)移到一個糖基受體的特定羥基基團上，形成糖苷鍵的共價連接。由于其在高效合成

2、高度空間特異性和立體化學特異性的糖苷鍵方面展現(xiàn)出的優(yōu)勢，利用糖基轉(zhuǎn)移酶催化糖鏈合成已經(jīng)成為利用有機化學手段合成糖鏈的有效替代途徑。有機合成手段可以為天然化合物提供多樣性的衍生物，為藥物丌發(fā)研究提供更多選擇性靶點。將生物酶法和化學法結(jié)合的化學-酶法合成，是近年來廣泛應(yīng)用于糖生物學研究領(lǐng)域的一個重要手段，有機合成和生物酶法優(yōu)勢互補,成為目前糖生物學和糖化學研究領(lǐng)域的一個充滿生機活力的研究方法和手段。
　　 糖核苷酸(nucleoti

3、de sugars)亦稱為活性糖(active sugars)，在化學結(jié)構(gòu)上是單糖的還原端和核苷一磷酸或二磷酸的末端磷酸基團結(jié)合形成的化合物。糖核苷酸的生理意義主要包括:1.通過糖核苷酸之間的相互轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生一系列糖基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)所必須的活性糖;2.在糖苷和多糖的生物合成過程中，作為糖的供體，是糖單元合成的前體。
　　 UDP-GlcNAc是細胞內(nèi)的一種重要的氨基糖供體，是細胞內(nèi)多種細胞分子合成的前體物質(zhì)。這些細胞內(nèi)分子主要包括

4、細胞壁肽聚糖、脂多糖、腸桿菌科細菌表面共同抗原、幾丁寡糖、GPI錨、糖胺聚糖和糖蛋白等。
　　 生物體內(nèi)UDP-G1cNAc的合成，都以己糖代謝途徑的中間產(chǎn)物果糖-6-磷酸(Fructose-6-P)為起始底物，在多種酶的協(xié)同催化作用下，最終合成UDP-GlcNAc。根據(jù)合成過程中催化反應(yīng)的順序及合成途徑所涉及酶的來源不同，分為真核UDP-GlcNAc合成途徑和原核UDP-G1cNAc合成途徑。兩種合成途徑的主要區(qū)別在于氨基葡萄

5、糖-6-磷酸(GlcN-6-P)的乙?；彤悩?gòu)化反應(yīng)的先后順序不同。真核合成途徑中，G1cN-6-P先在乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用下，生成乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸(G1cNAc-6-P)，然后再由異構(gòu)酶作用，生成乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸(GlcNAc-1-P);而原核合成途徑中，G1cN-6-P先異構(gòu)化為氨基葡萄糖-1-磷酸(G1cN-1-P)，然后再在乙酰轉(zhuǎn)移酶催化下生成G1cNAc-1-P。
　　 本論文以大腸桿菌K12來源的GlmU

6、為研究對象，對GlmU和GlmU的N-端結(jié)構(gòu)域GlmU-Tr229的底物廣泛性進行了系統(tǒng)研究。除了以揭示它們的底物適應(yīng)性、酶的動力學性質(zhì)和催化機理為目的的生化研究，本論文還通過體外小量合成反應(yīng)驗證了GlmU在氨基糖核苷酸合成中的潛在應(yīng)用價值;本論文還就GlmU突變體進行了初步研究，取得了一定的成果。
　　 論文第二章我們克隆了來自Escherichia coli K12的GlcNAc-1-P尿苷轉(zhuǎn)移酶(GlmU)，IPTG誘導G

7、lmU蛋白在E.coli BL21(DE3)中表達，帶有N-端His標簽的GlmU蛋白經(jīng)過Ni-NTA純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，GlmU純度達到90％以上，GlmU單體分子的表觀分子量約為50 kDa，與理論推導值基本一致。
　　 論文研究了底物GlcNAc-1-P的C2位化學修飾對GlmU催化反應(yīng)的影響。
　　 分別使用了C2位是羥基(Glc)，C2位為乙酰氨基(GlcNAc)和C2位為有疊氮基修飾(GlcN

8、AcZ)的三種不同糖-1-磷酸衍生物。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GlmU對三種糖-1-磷酸有不同的催化活性，以UTP為核苷三磷酸供體的反應(yīng)，使用GlcNAcZ-1-P和Glc-1-P的反應(yīng)得率分別是以GlcNAc-1-P為底物時反應(yīng)得率的86％和30％。以前的相關(guān)研究表明，GlcNAc-1-P的乙酰氨基與酶分子Thr82和Glu154殘基以氫鍵相互作用。Glc-1-P反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的降低進一步證明了Thr82和Glu154殘基在糖-1-磷酸識別中的重要

9、作用。相反，GlcNAcZ-1-P反應(yīng)轉(zhuǎn)化率沒有顯著變化的結(jié)果表明GlmU能夠耐受乙酰氨基上的修飾。
　　 第三章結(jié)合E.coli來源的GlmU已有晶體結(jié)構(gòu)，克隆并構(gòu)建了來自E.coli K12的GlmU的N-端結(jié)構(gòu)域(GlGNAc-1-P尿苷轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，GlmU-Tr229)，蛋白表達水平為55 mg/L。為系統(tǒng)研究GlmU-Tr229對不同核苷三磷酸的底物耐受性，研究中使用了GlcNAc-1-P做催化反應(yīng)底物，使用了12種

10、不同的核苷三磷酸(NTP)，利用毛細管電泳檢測NDP-GlcNAc的合成情況。NDP-GlcNAc產(chǎn)率結(jié)果顯示，GlmU-Tr229對不同核苷三磷酸具有一個底物耐受順序:UTP＞dUTP＞dTTP＞＞CTP＞dATP/dm6ATP，這結(jié)果表明GlmU對嘧啶核苷酸的利用程度要優(yōu)于對嘌呤核苷酸的利用。
　　 GlmU蛋白晶體研究結(jié)果已經(jīng)闡明GlmU N-端催化結(jié)構(gòu)域被兩個突出結(jié)構(gòu)包圍:第一個突出結(jié)構(gòu)(Asn3-Val111及His2

11、16-227)，主要參與識別和結(jié)合UDP-GlcNAc的核苷部分;第二個突出結(jié)構(gòu)(Glul12-Val215)則主要是與糖核苷酸中的糖結(jié)構(gòu)相互作用有關(guān)。尿嘧啶通過尿嘧啶環(huán)N3與Gln76之間及4位羰基氧與Gln76、Gly81之間形成的氫鍵被識別和結(jié)合。核苷中的核糖結(jié)構(gòu)，主要是通過核糖2位的OH基團與Gly14之間的氫鍵作用。我們對GlmU-Tr229的研究結(jié)果表明，GlmU N-端催化結(jié)構(gòu)域有非常顯著的底物耐受性，對核糖2位的修飾(d

12、UTP)或者是對尿嘧啶環(huán)C5修飾(dTTP)都不會顯著影響N-端催化結(jié)構(gòu)域的活性。這些結(jié)果表明，核糖2位OH與Gly14之間的氫鍵在底物識別過程中不是必需的。
　　 為驗證利用重組GlmU-Tr229合成UDP-GlcNAc衍生物的應(yīng)用前景，我們在毫克水平上合成了UDP-GlcNAc的兩種衍生物:dUDP-GlcNAc和UDP-GlcNAcZ。并使用mono Q離子交換層析和P2分子篩凝膠對糖核苷酸產(chǎn)物進行分離純化，最終使用ES

13、I-MS和NMR對得到的dUDP-GlcNAc(5.1 mg，57.6％)和UDP-G1cNAcZ(4.3 mg，44.4％)進行了定性分析。
　　 本論文對GlmU-Tr229生化性質(zhì)進行了細致的研究，闡述了GlmU-Tr229催化反應(yīng)需要依賴金屬離子做輔助因子，GlmU-Tr229對金屬離子的依賴性為:Co2+＞Mn2+＞Mg2+＞＞Zn2+/Cu2+/Ni2+＞EDTA;在以Mg2+為輔助因子的催化反應(yīng)體系中，5 mM M

14、g2+是最適的金屬離子濃度，研究了pH對GlmU-Tr229催化活性的影響，GlmU-Tr229最適pH是7.5，pH6.5-8.5范圍內(nèi)都能夠催化反應(yīng)的進行。
　　 我們還對催化反應(yīng)中副產(chǎn)物焦磷酸的反饋抑制作用進行了研究，通過在反應(yīng)體系中加入焦磷酸水解酶，將反應(yīng)體系中累積的焦磷酸水解為無機磷酸根，以UTP和GlcNAc-1-P為底物的催化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率由原來的65％提高到95％。
　　 第四章中，我們利用一種六碳糖激酶(

15、NahK)，以ATP和GlcNAc為底物，體外酶促反應(yīng)合成并分離純化獲得GlcNAc-1-P。探索了一條體外利用NahK合成GlmU反應(yīng)前體物質(zhì)GlcNAc-1-P的新途徑，解決了GlmU酶學研究底物供給不足的瓶頸。同時，為深入研究GlmU-Tr229底物特異性，我們對GlmU-Tr229的Gln76和Gly81氨基酸位點進行了定點突變研究，并對其中一個突變體Q76E進行了酶學性質(zhì)的研究。通過毛細管電泳檢測發(fā)現(xiàn)Q76E的突變引起了Glm