胸膜肺炎放線桿菌N-乙酰葡糖胺-1磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)及抑制劑篩選.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是引起的,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。UDP-乙酰葡萄糖胺(UDP-N-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)是病原菌細(xì)胞壁碳水化合物合成的必須前體,如肽聚糖、脂質(zhì)A、磷壁酸等,由雙功能酶N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶

2、(N-acetylglucosamine-1-phosphateuridyltransferase,GlmU)催化1-磷酸葡萄糖胺(glucosamine-1—phosphate,GlcN-1-P)、乙酰輔酶A和UTP經(jīng)過兩步反應(yīng)生成。如果干擾UDP-GlcNAc合成路徑將嚴(yán)重阻礙細(xì)菌的生長并影響其毒力,因此GlmU是一個(gè)重要的藥物靶標(biāo)。為了對(duì)GlmU先導(dǎo)化合物活性進(jìn)行研究,對(duì)GlmU蛋白的酶促動(dòng)力學(xué)分析是非常必要的。本論文主要對(duì)胸膜肺

3、炎放線桿菌GlmU蛋白進(jìn)行了研究,主要成果如下:
　　 1.glmU基因的克隆表達(dá)與純化
　　 根據(jù)NCBI Genebank中提供的胸膜肺炎放線桿菌血清3型JL03菌株全基因組序列設(shè)計(jì)引物。以胸膜肺炎放線桿菌JL03基因組為模板,采用PCR方法擴(kuò)增了glmU基因,將其克隆到了pET-28a表達(dá)載體上,并在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中進(jìn)行了高效表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析,結(jié)果表

4、明重組蛋白與預(yù)期分子量大小一致(50 KD),該蛋白的成功純化為下一步的研究奠定了良好基礎(chǔ)。
　　 2.GlmU尿苷酰轉(zhuǎn)移酶酶促動(dòng)力學(xué)分析
　　 采用孔雀石綠鉬酸銨顯色法測(cè)定了GlmU尿苷酰轉(zhuǎn)移酶的初速度,確定了其最佳陽離子表面活性劑是聚乙烯醇(PVA),最佳檢測(cè)波長為630 nm,最佳反應(yīng)溫度為37℃,最佳反應(yīng)時(shí)間為5 min,最佳反應(yīng)pH值為7.6,并在最佳反應(yīng)條件下測(cè)定了其酶促動(dòng)力學(xué)常數(shù):對(duì)于底物GlcNAc-1-

5、P,GlmU的Km值為0.05478 mM,最大速率Vmax為0.00370 mM min-1,對(duì)于底物UTP,GlmU的Km值為0.06608 mM,最大速率Vmax為0.00371 mM min-1。
　　 3.GlmU抑制劑的初步篩選
　　 運(yùn)用上述酶活測(cè)定體系評(píng)估了計(jì)算機(jī)虛擬篩選的44個(gè)先導(dǎo)化合物,得到了8個(gè)效果較好的抑制劑,分別對(duì)這8個(gè)先導(dǎo)化合物進(jìn)行了抑制常數(shù)和IC50的測(cè)定,為進(jìn)一步研究其抑制作用機(jī)理和研制新