大腸桿菌K12外排泵及調(diào)控基因缺失菌株的構(gòu)建及其功能的研究.pdf

1、細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性的產(chǎn)生伴隨著抗生素長(zhǎng)期大量的使用，細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生方式有多種，其中對(duì)于革蘭氏陰性桿菌中的大腸桿菌而言，外排泵AcrAB-TolC是引起其對(duì)多種抗生素耐藥的一個(gè)最重要的系統(tǒng)，本文旨在研究外排泵基因或者部分調(diào)控基因缺失后菌株在環(huán)丙沙星選擇壓力下耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制。
　　本研究首先利用Red同源重組建立了大腸桿菌K12染色體基因敲除技術(shù)，將以?xún)啥藬y帶FRT序列的質(zhì)粒pKD3和pKD4為模板擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物成功替代了大腸

2、桿菌K12中的acrA、acrB、tolC、marA、marR、soxS和soxR，獲得了外排泵基因及調(diào)控基因敲除菌，測(cè)定原菌K12以及7株敲除菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，利用半固體瓊脂方法測(cè)定了8株菌的移動(dòng)能力，發(fā)現(xiàn)各敲除菌的生長(zhǎng)速率以及移動(dòng)能力沒(méi)有顯著改變。
　　在環(huán)丙沙星濃度遞增的條件下誘導(dǎo)K12及其敲除菌株，分別獲得系耐藥菌株，采用二倍稀釋法測(cè)定各菌株的MIC，利用PCR的方法檢測(cè)了gyrA、gyrB、parC和parE基因QRDR區(qū)的

3、突變以及負(fù)向調(diào)控因子acrR、marR、soxR突變情況。利用RT-PCR方法檢測(cè)了誘導(dǎo)突變株中外排泵基因、調(diào)控基因和膜孔蛋白基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，當(dāng)敲除AcrAB-TolC中的tolC基因時(shí)，在濃度遞增的環(huán)丙沙星選擇壓力下很難篩選出耐藥菌株，說(shuō)明AcrAB-TolC的完整性對(duì)菌株耐藥性發(fā)展有重要作用。誘導(dǎo)耐藥株靶位基因突變類(lèi)型具有多樣性，與耐藥有關(guān)的突變位點(diǎn)有GyrA的Ser83Leu、Asp87Gly、Asp87His和ParC

4、的Gly78Asp。外排泵基因acrA或者acrB基因缺失的菌株，其獲得低水平耐藥主要與靶位基因突變有關(guān)，其獲得高水平耐藥主要由于與其存在功能冗余的外排泵AcrEF被激活，增加藥物外排所致。誘導(dǎo)耐藥發(fā)展過(guò)程中，菌株的膜孔蛋白OmpF的表達(dá)水平不斷下降，使得藥物進(jìn)入細(xì)胞的通道減少。
　　正向調(diào)控基因marA和soxS缺失后，在環(huán)丙沙星選擇壓力下僅能篩選出對(duì)環(huán)丙沙星敏感性降低的菌株，而負(fù)調(diào)控基因marR和soxR缺失后，在環(huán)丙沙星選擇