大腸桿菌K1致病株外膜蛋白T毒力相關功能研究.pdf

1、大腸桿菌是存在于人和許多動物腸道中的優(yōu)勢菌群,主要寄生在大腸內(nèi),屬于腸道正常菌群成員之一,某些血清型菌株的致病性強,可引起腹瀉等腸道內(nèi)感染,另一類大腸桿菌在一定條件下可引起腸道外感染,稱之為腸外致病性大腸桿菌,可引起泌尿系統(tǒng)感染,敗血癥和腦膜炎等。
　　 本文為了研究ompT基因在大腸桿菌Kl株感染中的毒力機制,利用染色體同源重組構建了大腸桿菌K1致病株E44的ompT基因敲除株,人BMEC單層細胞體外.BBB模型顯示,ompT

2、基因敲除導致大腸桿菌K1株體外黏附及侵襲BMEC能力降低,OmpT低表達水平質(zhì)?？梢曰净匮a突變株黏附能力至野生株水平；OmpT的表達可增強菌株的細胞毒效應；血源擴散乳鼠腦膜炎動物實驗證實,ompT基因敲除后菌株突破BBB的能力大大降低；OmpT體外功能研究表明,兩步柱層析純化得到的大腸桿菌K1株外膜蛋白組分可以激活人血纖溶酶原并呈一定量效關系；利用超濾結合陽離子交換層析制備了人尿來源抗菌肽,和野生株相比,ompT基因敲除株對尿陽離子抗

3、菌肽的抵抗能力降低。
　　 一、大腸桿菌K1致病株ompT基因敲除及特性分析
　　 1、為了研究omp7基因在大腸桿菌致病中的毒力相關功能,構建ompT基因敲除株OTD3。以E44基因組為模板,通過OMT-S1和OMT-B1引物PCR擴增得到1.57 kb的片段FOT5,通過OMT-B2和OMT-X2引物PCR擴增得到1.27 kb的片段FOT3,兩個DNA片段利用引物引入的BamH Ⅰ位點連接得到2.84 kb的omp

4、T基因中間缺失片段FOT53。利用Sal Ⅰ及Sac Ⅰ位點連入自殺載體pCVD442,構建重組自殺性質(zhì)粒pCVT53,pCVT53轉化入SM10λpir,與E44野生株接合轉移,PCR篩選得到突變株并命名為OTD3,并測序驗證基因缺失。
　　 2、K1株E44的ompT基因全長954 bp,編碼317個氨基酸,前20個氨基酸為信號肽序列,BLAST表明與大腸桿菌K12株OmpT(P09169316氨基酸)有96.2％氨基酸序列

5、同源性,兩者僅在肽鏈C端有部分氨基酸序列存在差異,C末端并不參與構成酶活性中心及維持蛋白特定空間構象。將帶有完整ORF的ompT基因序列插入質(zhì)粒pUC13得到重組質(zhì)粒pUCT。ompT基因處于lac_promoter的操控,用作回補實驗載體。
　　 3、與E44相比,OTD3表現(xiàn)出了微弱的生長優(yōu)勢,E44及OTD3菌體的菌落形成能力并無顯著差異。ompT的敲除并未影響大腸桿菌重要黏附素Ⅰ型菌毛的表達?？傮w上ompT敲除對K1株基

6、本屬性無顯著影響,因而突變株適用于研究該基因?qū)Ω腥鞠嚓P毒力的影響。
　　 4、魚精蛋白是一類天然的陽離子抗菌肽,富含連續(xù)的Arg。我們考察了0、0.0l、0.1和1 mg/ml的魚精蛋白對E44生長的影響,高濃度魚精蛋白直接殺滅菌體,低濃度范圍內(nèi)對菌體生長有抑制作用,且呈一定量效關系。與野生株E44相比,OTD3對0.1 mg/ml的魚精蛋白敏感,引起生長抑制。同樣的結果也在基因工程常用菌株BL21(DE3)、JM109及DH5

7、α中得到證實,ompT+株對魚精蛋白的殺菌活性表現(xiàn)出了更強的抵抗。魚精蛋白是OmpT的底物,對其敏感性間接反映了OmpT的表達水平及質(zhì)粒回補效果,在隨后的侵襲相關研究中,利于對比OmpT的表達對侵襲各環(huán)節(jié)的影響。
　　 二、ompT基因敲除降低大腸桿菌K1株致病能力
　　 1、體外模型采用人BMEC單層細胞,實驗前24 h,將BMEC鋪至24孔板,待細胞匯合成單層后備用(約105細胞/孔)。待測細菌37℃靜置培養(yǎng)24 h

8、至穩(wěn)定期,PBS適當稀釋備用,以OD600估算菌濃,按感染倍數(shù),即細菌數(shù):細胞數(shù)約100:1接入待測菌,同時留樣涂平板培養(yǎng)計數(shù)得確切菌濃。37℃孵育2 h后,PBS清洗4次后裂解細胞并涂布LB平板計菌落數(shù),此為黏附的細菌總數(shù),并計算黏附率。侵襲組三個復孔,與100μg/ml慶大霉素37℃孵育1 h來殺死所有胞外細菌,PBS清洗4次,裂解細胞涂布LB平板計菌落數(shù),即為胞內(nèi)菌數(shù),并計算侵襲率。與野生株E441、2和3 h的黏附率相比,OTD

9、3黏附BMEC單層細胞能力顯著降低。慶大霉素保護實驗結果表明,侵襲能力上也表現(xiàn)出了相應比例的降低,侵襲能力降低源于黏附能力的降低。OTD3轉化入低OmpT表達水平的回補質(zhì)粒pGEM-OmpT后,突變株黏附能力基本得到恢復,而OmpT高表達質(zhì)粒pML19并不能回補突變株黏附能力。推測BMEC表面存在某種OmpT的底物,對其適度的水解利于菌體黏附過程。
　　 2、待測菌37℃靜置培養(yǎng)24 h至穩(wěn)定期,PBS適當稀釋后,取約107細菌

10、接入?yún)R合的BMEC單層中,37℃孵育2,4和6 h,取上清并測定LDH活性,LDH釋放活性大小間接反映了細胞膜的受損程度。與ompT基因缺失株OTD3相比,野生株E44感染后4和6 h的細胞毒效應更高。轉化了pML19的OTD3,過表達的OmpT介導的細胞毒效應明顯高于攜帶空載體pUC19的野生株E44。與空白對照相比,ompT的非致病株BL21(DE3)與BMEC孵育也可以引起輕微的細胞毒效應,轉化了pML19后,BL21(DE3)/

11、pML19的細胞毒效應大幅地提升。不同菌株的細胞毒效應反映了一個趨勢,OmpT的表達量與LDH的釋放即胞膜損傷正相關,某種程度上證明了BMEC胞膜表面存在著OmpT的作用底物。
　　 3、五日齡的乳鼠被接種同劑量的E44及OTD3,感染18 h后,血樣及CSF樣本涂布LB平板計菌落數(shù)。接種ompT基因缺失株OTD3可以引起與野生株E44相似水平的菌血癥,23只接種了OTD3的乳鼠只有7只發(fā)生腦膜炎(30％),而17只接種了野生株

12、E44的乳鼠當中,12只CSF培養(yǎng)呈陽性,占了71％。omp7基因缺失顯著降低了大腸桿菌K1株穿越BBB的能力,與前面BMEC單層培養(yǎng)的體外BBB模型結果相符,綜合體內(nèi)外實驗結果,ompT作為一種輔助毒力因子與菌體侵入BBB相關。
　　 三、大腸桿菌K1株OmpT體外功能
　　 1、裂解E44菌體,膜組分沉淀經(jīng)反復抽提粗純化后上樣至絲氨酸蛋白酶抑制劑親合層析柱Benzamidine Sepharose Fast Flow

13、,NaCl梯度洗脫,分段收集并電泳檢測,按分子量判斷外膜蛋白集中在200 mmol/L NaCl洗脫,此步親和層析去掉絕大部分雜蛋白；再經(jīng)SOURCE 30Q強陰離子交換層析進一步精純,收集約180 mmol/L NaCl洗脫組分,得到較純的外膜蛋白,主要由二個條帶組成,為分子量集中在37 kDa的包括OmpT在內(nèi)的大腸桿菌外膜組分,可用于隨后的體外活性研究。
　　 2、S-2251生色發(fā)光底物法測定外膜蛋白對人血纖維蛋白溶酶原

14、(plasminogen,Pig)的激活效應,激活產(chǎn)生的纖溶酶plasmin水解S-2251釋放對硝基苯胺(pNA),pNA在405 nm處有強吸收,pNA顯色的深淺與激活劑的活性成正比。由于商品化Plg中,殘存少量纖溶酶,所以對照組Plg的OD405也呈上升趨勢。實驗組加入高低兩個濃度的E44膜組分,Plg被激活,曲線斜率呈上升趨勢,表明Plg不斷被激活,且與膜組分的加入量呈一定量效關系。而ompT敲除株OTD3制備的外膜組分不具有體

15、外激活Plg的效應。利用相關毒力因子激活纖溶酶原是普遍存在的病原體突破宿主生理屏障、獲取養(yǎng)分及逃避宿主防御機制的策略。
　　 3、采用1 kDa截留分子量的Pellicon超濾膜對尿液中全蛋白進行快速富集,隨后采用50 kDa截留分子量的超濾膜按分子量進行分級分離,收集超穿組分即得MW<20 kDa的小分子尿蛋白,大分子量尿蛋白被截留。各步純化組分均用BL21(DE3)作為測定菌株,瓊脂糖擴散法測定抗菌活性。結果表明只有小分子尿

16、蛋白組分表現(xiàn)出了明顯的抗菌活性。弱陽離子交換CM Sepharose Fast Flow柱層析純化得到尿來源小分子陽離子肽。TSK G2000SWx1凝膠過濾HPLC分析各步分離組分的分子量分布,50 kDa超穿組分分子量呈多峰分布,經(jīng)過陽離子交換層析后,得到了分子量分布呈單峰的洗脫組分,50 kDa超濾與陽離子交換層析兩步即可制備分子量分布均一的尿來源陽離子肽類,代表了正常尿液中存在的抗菌肽類,隨后考察了OmpT是否賦予了大腸桿菌對尿

17、抗菌肽的抵抗能力。
　　 4、ompT陽性株表現(xiàn)出更強的抵抗尿抗菌肽殺菌活性的能力。培養(yǎng)過程中加入尿陽離子肽,K1株E44表現(xiàn)出了對抗菌肽更強的抵抗能力,生長速率高于其ompT基因缺失株OTD3,ompT基因的敲除,降低了OTD3抵抗尿抗菌肽的能力。同時我們考察了基因工程常用菌株BL21(DE3)(ompT突變)和DH5α(ompT陽性)的尿來源抗菌肽的敏感性。20 μg/ml的尿抗菌肽加入后,BL21(DE3)的生長被完全抑制

18、,甚至被殺滅。pML19回補后,過表達的OmpT抑制了BL21(DE3)/pML19生長的同時,也增強了其對尿陽離子肽的抵抗,但卻沒有達到DH5α對尿抗菌肽的抵抗能力。結果表明OmpT參與了尿來源陽離子肽類的水解失活。機體各組織細胞尤其是上皮細胞、吞噬細胞等都維持一定水平的抗菌肽表達,在炎癥及感染發(fā)生時,抗菌肽表達水平會被迅速上調(diào)并持續(xù)高水平分泌,構成固有免疫的防御系統(tǒng)重要組成部分。病原體會通過各種途徑實現(xiàn)對宿主抗菌肽殺菌活性的抵抗,來