人EGF-IL-18融合蛋白的表達(dá)純化及實(shí)驗(yàn)室中試.pdf

1、目的： 構(gòu)建EGF-IL-18融合基因的原核表達(dá)載體，分離純化有活性的EGF-IL-18融合蛋白，使用發(fā)酵技術(shù)大量培養(yǎng)工程菌，得到大量重組EGF-IL-18融合蛋白，為進(jìn)一步研究其體外和動物體內(nèi)的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.EGF-IL-18融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)采用PCR方法，以質(zhì)粒pFUS-EGF-IL-18為模板，擴(kuò)增EGF-IL-18融合基因，并將其分別亞克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET12

2、a(+)、pET26b(+)，構(gòu)建二種表達(dá)載體pET12a(+)-EGF-IL-18、pET26b(+)-EGF-IL-18，限制性內(nèi)切酶雙酶切和測序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。將二種表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliRosetta(DE3)，IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)，SDS-PAGE和免疫印跡分析表達(dá)產(chǎn)物。 2.EGF-IL-18融合蛋白包涵體的復(fù)性及純化分離EGF-IL-18融合蛋白包涵體，并用2M尿素和1％。TritonX-100反復(fù)洗滌。以

3、8M尿素溶解包涵體，將包涵體裂解液上樣于弱陰離子交換柱DEAE-SFF，進(jìn)行柱上復(fù)柱，復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)一步用分子篩SephadexG-75純化。 3.體外實(shí)驗(yàn)檢測EGF-IL-18融合蛋白的初步生物學(xué)活性將純化的EGF-IL-18融合蛋白復(fù)性純化產(chǎn)物與人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)共培養(yǎng)24h，ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ的分泌水平來初步評價EGF-IL-18融合蛋白的復(fù)性效果和生物學(xué)活性。 4.利用發(fā)酵技術(shù)大量培

4、養(yǎng)工程菌分別運(yùn)用LB培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基對工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并運(yùn)用BIO-FLO發(fā)酵系統(tǒng)對發(fā)酵條件經(jīng)行監(jiān)控和優(yōu)化。 結(jié)果： 1.原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)雙酶切分析以及測序結(jié)果表明原核表達(dá)載體pET12a(+)-EGF-IL-18、pET26b(+)-EGF-IL-18與設(shè)計相符；工程菌E.coliRosetta(DE3)/pET12a(+)-EGF-IL-18誘導(dǎo)表達(dá)后在分子量為21kDa處可產(chǎn)生特異的

5、表達(dá)條帶，并能夠被抗人IL-18單克隆抗體所識別。工程菌E.coliRosetta(DE3)/pETl2a(+)-EGF-IL-18誘導(dǎo)表達(dá)后在分子量為21kDa處可產(chǎn)生特異的表達(dá)條帶，并能夠被抗人IL-18單克隆抗體所識別，與預(yù)期一致。 2.EGF-IL-18融合蛋白包涵體的復(fù)性及純化變性的EGF-IL-18融合蛋白包涵體經(jīng)陰離子交換層析柱DEAE-SFF柱上復(fù)性和凝膠過濾層析SephadexG-75進(jìn)一步純化后純度達(dá)95％

6、。 3.體外實(shí)驗(yàn)檢測EGF-IL-18融合蛋白的初步生物學(xué)活性IFN-γELISA結(jié)果顯示，EGF-IL-18融合蛋白具有明顯地誘導(dǎo)KG-1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力，但活性低于標(biāo)準(zhǔn)MetIL-18。 4.利用發(fā)酵技術(shù)大量培養(yǎng)工程菌通過發(fā)酵培養(yǎng)，普通LB培養(yǎng)基發(fā)酵可以一次性得到66.6g菌和10.5g包涵體；半合成培養(yǎng)基可以一次性得到198.2g菌和29.4g包涵體；而合成培養(yǎng)基發(fā)酵運(yùn)用補(bǔ)料技術(shù)可以一次性得到482g菌