IER5原核表達(dá)載體的構(gòu)建及融合蛋白表達(dá)、純化.pdf

1、IER5為Immediate Early Response gene 5基因的簡(jiǎn)稱，是早期反應(yīng)基因家族中的一員。經(jīng)檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)獲悉，目前人們對(duì)IER5基因研究不是很多，現(xiàn)有的研究顯示IER5基因表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡具有調(diào)節(jié)作用，參與了細(xì)胞對(duì)促有絲分裂信號(hào)反應(yīng)的調(diào)節(jié)。我們前期研究結(jié)果顯示：輻射后淋巴母細(xì)胞(AHH-1)、宮頸癌(Hela)細(xì)胞和肝癌(HepG2)細(xì)胞的IER5基因表達(dá)上調(diào)；抑制IER5基因表達(dá)，Hela和HepG

2、2細(xì)胞增殖變快，細(xì)胞對(duì)輻射的拮抗性增強(qiáng)，輻射敏感性減弱，且IER5基因沉默Hela細(xì)胞體積比正常腫瘤細(xì)胞大；與之相反，增加IER5表達(dá)，Hela和HepG2細(xì)胞增殖減慢，且IER5基因高表達(dá)Hela細(xì)胞尺寸明顯小于正常腫瘤細(xì)胞、輻射后凋亡比例增大，IER5高表達(dá)細(xì)胞的抗輻射能力減弱，輻射敏感性增強(qiáng)。這些研究提示我們IER5基因與肝癌、宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，參與了細(xì)胞周期的調(diào)控，可能類似于抑癌基因的功能。這些研究結(jié)果提示我們有必要對(duì)IE

3、R5基因展開更深入的研究，進(jìn)一步闡明該基因的生物學(xué)功能，有可能為腫瘤放療尋找到新的輻射敏感基因，以提高臨床腫瘤放療效果。
　　 IER5為沒有內(nèi)含子的基因，整個(gè)cDNAGC含量為60.5％（開放閱讀框架為71.7％），在PCR過程成中形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，給人工合成IER5融合蛋白和單克隆抗體帶來難度。單克隆抗體具有易于制備、理化性質(zhì)均一、生物活性單一、特異性強(qiáng)、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。使用單克隆抗體，能提高免疫學(xué)檢驗(yàn)和臨床治療的特異性

4、和準(zhǔn)確性，對(duì)生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域有著重要的意義[13]。目前市場(chǎng)只有IER5多克隆抗體，在用于蛋白質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中與IER5相互作用蛋白和Western-blot實(shí)驗(yàn)中IER5蛋白的檢測(cè)時(shí)效果不佳，這給進(jìn)一步研究IER5基因的生物學(xué)功能帶來困難，因此本課題組決定制備IER5單克隆抗體，合成IE5融合蛋白是制備IER5單克隆抗體的關(guān)鍵一步，由于研究時(shí)間有限，本研究擬采用Real-timePCR、SDS-PAGE、Western

5、blot等方法制備大量重組IER5融合蛋白，為制備IER5單克隆抗體做準(zhǔn)備，為進(jìn)一步深入研究IER5基因在肝癌等腫瘤輻射治療中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 目的：本課題采用PCR、SDS-PAGE、Western blot等方法，通過誘導(dǎo)表達(dá)、超聲破碎、變性、復(fù)性、過NI-NTE鎳柱、透析、聚乙二醇濃縮等實(shí)驗(yàn)技術(shù)純化蛋白以獲得大量IER5重組融合蛋白，為IER5單克隆抗體制備做準(zhǔn)備。
　　 方法：人工合成IER5基因，將該基因

6、轉(zhuǎn)入原核表達(dá)載體pET22b(+)和pGEx-5T中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序正確后，提取質(zhì)粒，再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli BL21(DE3)。即構(gòu)建原核pET22b(+)-IER5、pGEx-5T-IER5表達(dá)載體，通過異丙基2B2D2硫代半乳糖苷(IPTG)在大腸桿菌系統(tǒng)穩(wěn)定地表達(dá)融合蛋白pET22b(+)-IER5，利用Western blot和SDS-PAGE檢測(cè)pET22b(+)-IER5。應(yīng)用咪唑與融合

7、蛋白競(jìng)爭(zhēng)地與鎳離子結(jié)合將融合蛋白洗脫下來。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建pET22b(+)-IER5、pGEx-5T-IER5表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌,篩選陽(yáng)性克隆將pET22b(+)-IER5誘導(dǎo)表達(dá)。確定了其原核表達(dá)的關(guān)鍵表達(dá)參數(shù)：誘導(dǎo)溫度為37度，誘導(dǎo)時(shí)間為4h及IPTG濃度為0.01mmol/l，使之可以在大腸桿菌中穩(wěn)定表達(dá)。通過8M尿素變性、HisTrapHP親和層析柱、透析、濃縮等技術(shù)獲得表達(dá)產(chǎn)物pET22b(+)-IER5