融合蛋白d-EGF的結構預測、克隆、原核表達及鑒定.pdf

1、目的：對融合蛋白 d-EGF二級、三級結構進行預測并分析其活性部位的可能影響，進行原核表達，并對表達產物進行分析鑒定。
　　方法：以融合蛋白質基因序列為基礎，用DNAStar軟件預測其蛋白質的二級結構；用Insight II軟件對其三級結構進行建模預測。在對融合蛋白理論預測的基礎上，分別構建含β-defensin-3、EGF的重組質粒，應用重組PCR等方法，將EGF的基因序列融合到β-defensin-3 DNA序列的3’末端，將

2、融合基因克隆入原核表達載體pET-SUMO,構建目的重組質粒 pET-SUMO-d-EGF。采用 PCR、測序等方法對目的基因是否正確重組進行鑒定；以重組質粒轉化大腸桿菌E.coli BL21（DE3），以IPTG誘導表達目的蛋白質，表達產物經過Ni-trap柱純化，SDS-PAGE檢測表達初產物及純化產物。最后用Western-blot對其特異性進行鑒定；用MTT法檢測其促細胞增殖活性；用紙片擴散法藥物敏感試驗、微量稀釋法檢測其抗菌活

3、性。
　　結果：采用DNAStar軟件的Gamier Robson方法預測的結果表明，融合蛋白質d-EGF含較多的β折疊結構；Charge Density-Charge法預測蛋白質3-22、31-48區(qū)段帶豐富的正電荷；Insight II軟件分析顯示重組蛋白d-EGF中原蛋白β-defensin-3、EGF三級結構中的活性必須的六個鏈內二硫鍵在融合蛋白中都能夠正確形成，維持β-defensin-3三級結構的3個反向平行的β折疊片

4、結構在融合蛋白中能夠形成。融合蛋白的結構含有原蛋白β-defensin-3、EGF的生物活性結構。成功構建β-defensin-3、EGF重組質粒，經重組PCR成功擴增出294bp的目的片段，重組體PCR結果與預期結果一致，測序正確。轉入重組質粒的E.coli BL21（DE3）經IPTG誘導、SDS-PAGE分析得到28 kD左右的目的蛋白條帶。用Western-blot鑒定出融合蛋白含有EGF，β-防御素-3的相應蛋白抗原表位。用

5、MTT法測得融合蛋白 d-EGF EC50約為0.4ng/ml,與EGF標準品EC500.08-0.8 ng/ml相符；用紙片擴散法藥物敏感實驗檢測對金黃色葡萄球菌有明顯抑菌環(huán)出現，抑菌濃度25μg/ml相對標準品 hβ-defensin-3的MIC12.5μg/ml，說明d-EGF抑菌活性比標準品相對弱一些。
　　結論：在預測融合蛋白 d-EGF的二、三級結構的基礎上，成功構建原核表達載體pET-SUMO d-EGF,并表達出純