人脂聯(lián)素基因克隆、融合表達(dá)及純化的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建重組人脂聯(lián)素(adiponectin,ADPN)原核表達(dá)載體,獲取同源性、可溶性、高純度的人重組脂聯(lián)素融合蛋白,為進(jìn)一步脂聯(lián)素的深入研究及Ⅱ型糖尿病的早期診斷奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：從人脂肪組織中提取RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增,克隆出脂聯(lián)素基因；用EcoRⅠ和HIndⅢ對人脂聯(lián)素基因和載體pET32進(jìn)行雙酶切,構(gòu)建pET32-ADPN重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞,通過氨芐青霉素抗性、PCR和重組質(zhì)粒雙酶切

2、篩選重組子轉(zhuǎn)化菌落,經(jīng)DNA測序及BLAST比對確認(rèn)脂聯(lián)素基因序列正確性以及插入pET32質(zhì)粒的位點(diǎn)和方向；用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、Western blotting鑒定,用鎳離子金屬螯合層析柱純化重組融合蛋白。
　　 結(jié)果：(1)通過RT-PCR,經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳觀察,擴(kuò)增的脂聯(lián)素DNA片段與預(yù)期大小一致。(2)經(jīng)雙酶切及DNA測序鑒定脂聯(lián)素DNA定向插入了pET32質(zhì)粒。(3)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21、誘導(dǎo)表達(dá)和純化目