水貂生長激素基因的克隆、真核表達載體的構建及其在細胞與機體中的表達研究.pdf

1、水貂是一種具有很高經濟價值的毛皮動物，其個體大小與被毛質量是決定皮張等級和價格的關鍵因素。本研究利用基因工程技術，克隆帶有信號肽序列的水貂生長激素基因，構建成真核表達載體或重組腺病毒，直接注射入水貂體內，實現促進水貂生長，增加水貂體長之目的。 在已獲得水貂腦垂體cDNA的基礎上，根據已經報道的水貂生長激素基因序列設計特異性PCR引物，進行特異性擴增，成功獲得了帶有信號肽序列的780bp水貂生長激素基因。將其克隆到pEasy-T載

2、體上，構建成pTmGH克隆載體。 將已獲得的水貂生長激素基因定向插入pVAX1真核表達載體中，構建由CMV啟動子調控的真核表達載體pCMVmGH。將從p△EMTCD中獲得的MT啟動子插入pCMVmGH中CMV啟動子下游，構建由CMV及MT雙啟動子調控的表達載體pCMTmGH。然后用MT啟動子置換pCMVmGH中的CMV啟動子，構建由MT啟動子調控的真核表達載體pMTmGH。對上述3種真核表達載體分別進行酶切鑒定和序列測定，證實已

3、成功構建了3種含有不同啟動子的水貂生長激素真核表達載體。 利用脂質體轉染法將上述三種真核表達載體在BHK細胞中進行瞬時表達，結果表明三種真核表達載體都可以在真核細胞中表達。 將上述三種真核表達載體直接注射入2月齡水貂后肢肌肉內。每種重組質粒分兩個劑量進行注射，即100μg/只、200μg/只。注射后以500mg/kg的ZnSO<,4>隔日進行誘導。實驗期為兩個月，注射前當天及注射后第60天分別稱量體重，進行統(tǒng)計學處理。結

4、果表明真核表達載體pCMTmGH、100μg/只的實驗組與對照組相比體重明顯增加(P<0.05)。 以上結果表明，將水貂生長激素真核表達載體直接肌肉注射入水貂體內，可以促進水貂的生長發(fā)育，具有重要的理論意義及經濟價值。 此外，本文還利用PCR技術，在已克隆的水貂生長激素基因兩端添加上KpnI酶切位點，然后克隆到pEasy-T載體上，構建成pmGH克隆載體。pmGH進行KpnI酶切，回收水貂生長激素基因小片段，與同樣酶切后