SLC基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在COS-7細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的次級(jí)淋巴組織趨化因子(secondarylymphoidtissuechemokine，SLC)又稱(chēng)為CCL21(CCchemokineligand21)、6Ckine、exodous2、TCA4等，是趨化因子家族CC亞族中的成員，對(duì)多種免疫細(xì)胞具有趨化作用。研究表明，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用的免疫細(xì)胞，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC和NK細(xì)胞，膜表面均表達(dá)SLC的受體CCR7。SLC通過(guò)與CCR7結(jié)合，募集免疫細(xì)胞向腫瘤局部遷移、

2、浸潤(rùn)，刺激它們產(chǎn)生IFN-γ、GM-CSF、IL-12等細(xì)胞因子，增強(qiáng)非特異性免疫，抑制腫瘤血管生成，因而具有顯著的抗腫瘤作用，是目前腫瘤免疫治療的理想效應(yīng)分子。研究證實(shí)，重組蛋白SLC瘤內(nèi)注射能產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤免疫效應(yīng)，并抑制腫瘤的生長(zhǎng)。然而，SLC蛋白注射療法不可避免的具有反復(fù)、多次、大劑量注射所帶來(lái)的副作用，且效果不持久。 為了深入研究SLC對(duì)免疫細(xì)胞的趨化活性、促增殖作用及在抗腫瘤作用中的地位，探索SLC基因免疫治療腫瘤

3、的有效途徑，本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建含小鼠SLC全長(zhǎng)cDNA序列的真核表達(dá)載體，通過(guò)電穿孔法，以其轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，研究小鼠SLC在體外的瞬時(shí)表達(dá)，為進(jìn)一步利用小鼠SLC基因免疫治療腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。但是，用單獨(dú)的SLC基因治療時(shí)，存在局部濃度低、作用時(shí)間短的缺點(diǎn)，抗腫瘤的作用也有限：若與其它基因聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，SLC基因可表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)。因此，可選擇與SLC基因具有協(xié)同或/和互補(bǔ)免疫調(diào)節(jié)作用或/和抗腫瘤作用的細(xì)胞因子基因及協(xié)同刺激分子

4、基因，聯(lián)合進(jìn)行基因治療。 IL-2能作用于T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC及NK細(xì)胞等，促進(jìn)細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IFNα、IL-4、TNF和CSF等細(xì)胞因子，同時(shí)還可增強(qiáng)CTL的細(xì)胞毒活性、激活NK、LAK細(xì)胞的直接殺傷作用等，有效地?cái)U(kuò)增針對(duì)腫瘤抗原的B細(xì)胞及T細(xì)胞應(yīng)答，常用于惡性腫瘤的免疫治療。SLC和IL-2在激發(fā)機(jī)體特異和非特異抗腫瘤免疫應(yīng)答方面均具有重要功能，可分別作用于抗原提呈細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。 本

5、實(shí)驗(yàn)中，我們擬通過(guò)PCR的方法克隆hSLC基因片段，然后將其插入到真核表達(dá)載體pIRES的多克隆酶切位點(diǎn)中，使hSLC基因置于能在真核細(xì)胞中高效表達(dá)的CMV啟動(dòng)予調(diào)控之下，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pSLC-IRES。我們以具有雙基因共表達(dá)特性的IRES相連處于同一啟動(dòng)子控制下的hSLC和hIL-2，構(gòu)建高效表達(dá)SLC和IL-2的共表達(dá)質(zhì)粒pSLC-IRES-IL-2，并探討表達(dá)的SLC和IL-2在抗腫瘤基因治療中的協(xié)同效應(yīng)，為進(jìn)一步運(yùn)用該共

6、表達(dá)質(zhì)粒對(duì)腫瘤進(jìn)行基因治療的實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。 研究?jī)?nèi)容及方法 1.重組共表達(dá)載體pSLC-IRES-IL-2的構(gòu)建及在COS-7細(xì)胞中的表達(dá) (1).用PCR擴(kuò)增SLC基因。 (2).以亞克隆技術(shù)構(gòu)建重組載體pSLC-IRES，并酶切鑒定。 (3).采用異硫氰酸胍一步法提取Jurkat細(xì)胞的總RNA。以提取的總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增IL-2基因。 (4).采用TA克隆技術(shù)構(gòu)建克隆

7、載體pMD-hIL-2，酶切鑒定并測(cè)序。 (5).利用亞克隆技術(shù)，構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒pSLC-IRES-IL-2，酶切鑒定。 (6).采用電穿孔法，以共表達(dá)質(zhì)粒pSLC-IRES-IL-2轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。 (7).Westernblot檢測(cè)重組蛋白表達(dá) 。2.小鼠SLC真核表達(dá)載體pVAX1-mSLC的構(gòu)建及瞬時(shí)表達(dá)。 (1).利用亞克隆技術(shù)，構(gòu)建重組載體pVAX1-mSLC，并酶切鑒定。

8、 (2).采用體外電穿孔法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。 (3).Westernblot檢測(cè)重組蛋白表達(dá)。 結(jié)果 1.重組共表達(dá)載體pSLC-IRES-IL-2的構(gòu)建及在COS-7細(xì)胞中的表達(dá) (1).以質(zhì)粒pSK-hSLC為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為420bp的hSLC基因片段，與預(yù)期的結(jié)果相一致。以XhoⅠ和EcoRⅠ酶切hSLC基因片段和載體pIRES后，進(jìn)行連接，菌落PCR篩選及XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶

9、切鑒定證實(shí)pSLC-IRES構(gòu)建成功。 (2).從人Jurkat細(xì)胞的總RNA中，用RT-PCR擴(kuò)增的含信號(hào)肽的hIL-2基因片段大小為510bp，與預(yù)期的結(jié)果相一致。 (3).取hIL-2基因的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α菌株。菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為510bp。XbalⅠ酶切重組質(zhì)粒后，得到250bp和2950bp大小的片段，表明目的基因片段已經(jīng)插入pMD18-T中。提取質(zhì)粒pMD-hIL

10、-2進(jìn)行測(cè)序，所測(cè)DNA的序列與GenBank中人IL-2cDNA的序列一致，表明擴(kuò)增的為人IL-2基因。 (4).取pSLC-IRES質(zhì)粒與經(jīng)同樣雙酶切質(zhì)粒pMD-hIL-2后獲得的hIL-2基因片段相連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α菌株。菌落PCR篩選及NotⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定證實(shí)，共表達(dá)質(zhì)粒pIRES-hSLC-hIL-2構(gòu)建成功。 (5).采用電穿孔法，以共表達(dá)質(zhì)粒pSLC-IRES-IL-2轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。We

11、sternblot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的COS-7細(xì)胞能分泌性表達(dá)SLC和IL-2蛋白。 2.小鼠SLC真核表達(dá)載體pVAX1-mSLC的構(gòu)建及瞬時(shí)表達(dá) (1).用BamHⅠ和XbaⅠ分別雙酶切克隆質(zhì)粒pMD-mSLC和pVAX1載體，回收410bp大小的mSLC片段及線(xiàn)性化pVAX1載體，進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10菌株。菌落PCR篩選及HinDⅢ酶切鑒定證實(shí)，表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-mSLC構(gòu)建成功。 (2).

12、采用電穿孔法，以表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-mSLC轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的COS-7細(xì)胞能表達(dá)mSLC。 結(jié)論 1.成功地構(gòu)建hSLC和hIL-2基因的共表達(dá)質(zhì)粒，以其轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，能分泌性表達(dá)SLC和IL-2，為探討SLC和IL-2在抗腫瘤基因治療中的協(xié)同效應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2.成功地構(gòu)建小鼠SLC基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-mSLC，以其轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，能瞬時(shí)