極端環(huán)境中嗜鐵鉤端螺旋菌的選擇性分離、鑒定與特性研究.pdf

1、各種證據(jù)表明，在溫度≥40℃、pH≤1.4時，鉤端螺旋菌在工業(yè)連續(xù)流生物反應槽中屬于主要的鐵氧化細菌。目前，在鉤端螺旋菌屬現(xiàn)存的三個種當中，僅僅嗜鐵鉤端螺旋菌能夠在45℃生長，此外，除了兩個抗砷基因被鑒定外，有關這個種的其他生物學特性的報道非常有限。因此，它已成為未來生物學研究的熱點。 然而，由于純培養(yǎng)的困難，有限的嗜鐵鉤端螺旋菌菌株被分離。在本研究中，以嗜鐵鉤端螺旋菌為主要研究對象，開展了其分離方法、生理生化特性、分子生物學鑒

2、定和磁小體的提取等研究工作，其主要內(nèi)容如下： 1．建立了一種分離嗜鐵鉤端螺旋菌的選擇性方法。 目前，分離嗜鐵鉤端螺旋菌的最成功方法是雙層平板法。其特點是采用了雙層平板以及異養(yǎng)細菌-Acidiphilium SJH的加入。盡管這種方法在鐵氧化細菌的分離方面非常有效，但雙層平板的制備比較繁瑣，加入的SJH菌株也并不容易獲得。因此，我們根據(jù)鉤端螺旋菌適宜的生長溫度、pH和某些生理生化特性，建立了一種相對簡單有效的選擇分離性方法

3、，其主要特點是給嗜鐵鉤端螺旋菌提供有利的生長條件，如低pH(≤1.4)、較高培養(yǎng)溫度(≥40℃)和較高氧化還原電位等?；谶@種方法，經(jīng)過連續(xù)稀釋，我們獲得了12株嗜鐵鉤端螺旋菌純培養(yǎng)物。此外，還用酵母HJM代替SJH菌株進行了雙層平板分離嗜鐵鉤端螺旋的嘗試。 2．以YSK菌株為研究對象，從形態(tài)學、生理生化及分子水平等方面進行了鑒定。 鉤端螺旋菌屬的各個成員之間在形態(tài)學和生理學上并沒有明顯的差異。形態(tài)學表明，YSK菌株可能

4、屬于一株氧化亞鐵鉤端螺旋菌。然而，基于以下幾種證據(jù)，證明YSK菌株屬于嗜鐵鉤端螺旋菌： ① 45℃時的生長能力。 ②與嗜鐵鉤端螺旋菌典型菌株Fairview的16S rDNA序列的100％的一致性； ③基因組G+C的相對百分含量為58.7％； ④與表3-2中其他菌株間16S-23S間隔區(qū)大小的差異； ⑤對黃鐵礦高效的浸出能力與對黃銅礦有限的浸出能力。 3．嗜鐵鉤端螺旋菌gyrB基因的PCR

5、擴增與克隆有關嗜鐵鉤端螺旋菌gyrB基因的研究還未見相關報道。在本研究中，采用本研究室設計的一對寡核苷酸簡并引物，首次報道了嗜鐵鉤端螺旋菌gyrB基因的PCR擴增與克隆，該基因的克隆為嗜鐵鉤端螺旋菌分子系統(tǒng)學的研究提供了分子標記。 4．嗜鐵鉤端螺旋菌的16S rDNA和gyrB基因的序列分析從功能基因gyrB和16S rRNA基因的角度探討了嗜鐵鉤端螺旋菌不同菌株間的系統(tǒng)發(fā)育關系。結果表明： ①探測到了14個信號位點，其

6、中9個信號位點分布于470-490位點之間。這些信號位點很有可能被用作識別嗜鐵鉤端螺旋菌不同菌株間的一種分子標記； ②15株嗜鐵鉤端螺旋菌可分成明顯的三組。相似性比較發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)發(fā)育間的相似性與礦物學特征間很可能存在某種必然的相關性； 5．磁小體的分離與純化首次通過蔗糖密度梯度離心和SDS處理法，從YSK菌株中分離出了納米磁性顆粒。透射電境表明，磁性顆粒近似球形，平均直徑為44nm。顆粒的大小屬于單磁疇結構；能譜分析表明，

7、這種磁性納米顆粒主要由鐵和氧兩種元素組成。由此初步推斷，這種顆粒就是磁小體。 6．不同鐵氧化細菌作用下形成的沉淀差異性分析通過ICP-AES，SEM，XRD和FTIR等方法，在不同溫度條件下，對不同鐵氧化細菌作用下形成的赭黃色高鐵沉淀進行了分析。結果表明，無論是嗜鐵鉤端螺旋菌DY菌株(L.ferriphium)，還是嗜酸氧化亞鐵硫桿菌GF菌株(At. ferrooxidans)作用下形成的沉淀都是黃鉀鐵礬和黃銨鐵礬的混合物。其中

8、，GF作用下形成的沉淀混合物中其黃鉀鐵礬的含量比DY作用下形成的黃鉀鐵礬約高出5.53％，而DY作用下形成的沉淀中，其黃銨鐵礬的含量比GF作用下形成的沉淀中的黃銨鐵礬的含量約高出15.24％。 7．酸性礦坑水中極端嗜酸又能耐受中強堿酵母的分離與鑒定采用平板劃線分離法，從江西某銅礦酸性礦坑水中分離出一株極端嗜酸、又能耐受中度堿性條件的異養(yǎng)微生物，命名為HJM菌株。該菌株能在pH1.5-10.0的范圍內(nèi)生長。形態(tài)學以及18S rDN