極端環(huán)境中嗜鐵鉤端螺旋菌的選擇性分離、鑒定與特性研究.pdf

1、各種證據(jù)表明，在溫度≥40℃、pH≤1.4時(shí)，鉤端螺旋菌在工業(yè)連續(xù)流生物反應(yīng)槽中屬于主要的鐵氧化細(xì)菌。目前，在鉤端螺旋菌屬現(xiàn)存的三個(gè)種當(dāng)中，僅僅嗜鐵鉤端螺旋菌能夠在45℃生長(zhǎng)，此外，除了兩個(gè)抗砷基因被鑒定外，有關(guān)這個(gè)種的其他生物學(xué)特性的報(bào)道非常有限。因此，它已成為未來生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。 然而，由于純培養(yǎng)的困難，有限的嗜鐵鉤端螺旋菌菌株被分離。在本研究中，以嗜鐵鉤端螺旋菌為主要研究對(duì)象，開展了其分離方法、生理生化特性、分子生物學(xué)鑒

2、定和磁小體的提取等研究工作，其主要內(nèi)容如下： 1．建立了一種分離嗜鐵鉤端螺旋菌的選擇性方法。 目前，分離嗜鐵鉤端螺旋菌的最成功方法是雙層平板法。其特點(diǎn)是采用了雙層平板以及異養(yǎng)細(xì)菌-Acidiphilium SJH的加入。盡管這種方法在鐵氧化細(xì)菌的分離方面非常有效，但雙層平板的制備比較繁瑣，加入的SJH菌株也并不容易獲得。因此，我們根據(jù)鉤端螺旋菌適宜的生長(zhǎng)溫度、pH和某些生理生化特性，建立了一種相對(duì)簡(jiǎn)單有效的選擇分離性方法

3、，其主要特點(diǎn)是給嗜鐵鉤端螺旋菌提供有利的生長(zhǎng)條件，如低pH(≤1.4)、較高培養(yǎng)溫度(≥40℃)和較高氧化還原電位等?；谶@種方法，經(jīng)過連續(xù)稀釋，我們獲得了12株嗜鐵鉤端螺旋菌純培養(yǎng)物。此外，還用酵母HJM代替SJH菌株進(jìn)行了雙層平板分離嗜鐵鉤端螺旋的嘗試。 2．以YSK菌株為研究對(duì)象，從形態(tài)學(xué)、生理生化及分子水平等方面進(jìn)行了鑒定。 鉤端螺旋菌屬的各個(gè)成員之間在形態(tài)學(xué)和生理學(xué)上并沒有明顯的差異。形態(tài)學(xué)表明，YSK菌株可能

4、屬于一株氧化亞鐵鉤端螺旋菌。然而，基于以下幾種證據(jù)，證明YSK菌株屬于嗜鐵鉤端螺旋菌： ① 45℃時(shí)的生長(zhǎng)能力。 ②與嗜鐵鉤端螺旋菌典型菌株Fairview的16S rDNA序列的100％的一致性； ③基因組G+C的相對(duì)百分含量為58.7％； ④與表3-2中其他菌株間16S-23S間隔區(qū)大小的差異； ⑤對(duì)黃鐵礦高效的浸出能力與對(duì)黃銅礦有限的浸出能力。 3．嗜鐵鉤端螺旋菌gyrB基因的PCR

5、擴(kuò)增與克隆有關(guān)嗜鐵鉤端螺旋菌gyrB基因的研究還未見相關(guān)報(bào)道。在本研究中，采用本研究室設(shè)計(jì)的一對(duì)寡核苷酸簡(jiǎn)并引物，首次報(bào)道了嗜鐵鉤端螺旋菌gyrB基因的PCR擴(kuò)增與克隆，該基因的克隆為嗜鐵鉤端螺旋菌分子系統(tǒng)學(xué)的研究提供了分子標(biāo)記。 4．嗜鐵鉤端螺旋菌的16S rDNA和gyrB基因的序列分析從功能基因gyrB和16S rRNA基因的角度探討了嗜鐵鉤端螺旋菌不同菌株間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果表明： ①探測(cè)到了14個(gè)信號(hào)位點(diǎn)，其

6、中9個(gè)信號(hào)位點(diǎn)分布于470-490位點(diǎn)之間。這些信號(hào)位點(diǎn)很有可能被用作識(shí)別嗜鐵鉤端螺旋菌不同菌株間的一種分子標(biāo)記； ②15株嗜鐵鉤端螺旋菌可分成明顯的三組。相似性比較發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)發(fā)育間的相似性與礦物學(xué)特征間很可能存在某種必然的相關(guān)性； 5．磁小體的分離與純化首次通過蔗糖密度梯度離心和SDS處理法，從YSK菌株中分離出了納米磁性顆粒。透射電境表明，磁性顆粒近似球形，平均直徑為44nm。顆粒的大小屬于單磁疇結(jié)構(gòu)；能譜分析表明，

7、這種磁性納米顆粒主要由鐵和氧兩種元素組成。由此初步推斷，這種顆粒就是磁小體。 6．不同鐵氧化細(xì)菌作用下形成的沉淀差異性分析通過ICP-AES，SEM，XRD和FTIR等方法，在不同溫度條件下，對(duì)不同鐵氧化細(xì)菌作用下形成的赭黃色高鐵沉淀進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，無論是嗜鐵鉤端螺旋菌DY菌株(L.ferriphium)，還是嗜酸氧化亞鐵硫桿菌GF菌株(At. ferrooxidans)作用下形成的沉淀都是黃鉀鐵礬和黃銨鐵礬的混合物。其中

8、，GF作用下形成的沉淀混合物中其黃鉀鐵礬的含量比DY作用下形成的黃鉀鐵礬約高出5.53％，而DY作用下形成的沉淀中，其黃銨鐵礬的含量比GF作用下形成的沉淀中的黃銨鐵礬的含量約高出15.24％。 7．酸性礦坑水中極端嗜酸又能耐受中強(qiáng)堿酵母的分離與鑒定采用平板劃線分離法，從江西某銅礦酸性礦坑水中分離出一株極端嗜酸、又能耐受中度堿性條件的異養(yǎng)微生物，命名為HJM菌株。該菌株能在pH1.5-10.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)。形態(tài)學(xué)以及18S rDN