嗜鐵鉤端螺旋菌Leptospirillum ferriphilum UBK03抗鎳基因的克隆及功能分析.pdf

1、UBK03來源于江西省“721鈾礦”沙洲礦區(qū)，是一株氧化能力極強的化能自養(yǎng)細菌，其生長最適pH為1.3-1.5，最適溫度為39-42℃，革蘭氏染色反應陰性，菌體在幼齡期為弧形，老齡期為螺旋狀，有鞭毛，好氧。根據(jù)其16SrDNA序列(GenBank登錄號：DQ534052)分析，發(fā)現(xiàn)它屬于鉤端螺旋菌中的GroupⅡ即嗜鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillumferriphilum)。利用該菌在培養(yǎng)過程中亞鐵離子的變化規(guī)律，分析了該菌對金

2、屬離子鎳、鈷、鋅、銅和鎘的抗性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌對金屬離子鎳的抗性最強。同時該菌對鋅及鈷離子也表現(xiàn)出較強的抗性，而對鎘及銅離子的抗性較弱。 提取嗜鐵鉤端螺旋菌UBK03的基因組DNA，構(gòu)建基因組文庫，從中篩選出一段能產(chǎn)生鎳抗性的DNA序列(GenBank登錄號DQ517331)。該段序列共有3991bp，命名為nr21，利用計算機分析發(fā)現(xiàn)這段序列中可能編碼四個和鎳抗性有關的基因分別命名為ncrA，ncrB，ncrC及ncrY,同時

3、還可能編碼三個啟動子，即p1，p2及p3。采用進化樹分析發(fā)現(xiàn)該菌株編碼的抗鎳系統(tǒng)是一種由MFS蛋白家族介導的抗鎳系統(tǒng)，而該菌是繼Klebsiellaoxytoca及Hafniaalvei5-5之后發(fā)現(xiàn)的第三種含有該類抗鎳系統(tǒng)的菌。 為了分析驗證克隆序列中編碼的四個基因的功能，分別制作了pNR21中四個基因(ncrA，ncrB，ncrC及ncrY)的插入突變(pNTA，pNTB，pNTC及pNTY)及刪除突變(pNDA，pNDB

4、，pNDC及pNDY)。然后分別分析了含有該突變質(zhì)粒的菌株對鎳的抗性，發(fā)現(xiàn)這四個基因的性質(zhì)是不同的。其中ncrA，ncrB及ncrC為結(jié)構(gòu)基因，這三個基因中任意一個突變都會抑制含有該突變體質(zhì)粒菌株的抗鎳能力。而基因ncrY的作用正好相反，它編碼一個能對整個抗鎳系統(tǒng)起到負作用的因子，該基因的突變會使含有該突變質(zhì)粒的菌株的鎳抗性能力提高。 通過測定比較同一種菌(含有質(zhì)粒pNR21或pNCRABC)在經(jīng)過鎳誘導及不誘導時的生長曲線，

5、發(fā)現(xiàn)未誘導菌比經(jīng)過誘導菌的生長至少延遲一個小時，因此從中可以發(fā)現(xiàn)克隆序列中編碼的抗鎳系統(tǒng)是由鎳誘導表達產(chǎn)生的，也說明在質(zhì)粒pNR21或pNCRABC上至少編碼了一個和鎳的誘導有關的蛋白。 將連有啟動子的序列片段連在報告基因lacZ的上游，發(fā)現(xiàn)單獨的啟動子p1及p2能組成型啟動報告基因的表達，而當抗鎳系統(tǒng)(由質(zhì)粒pNCRABC編碼)和p1-lcZ,p2-lacZ同時存在時這兩個啟動子(p1及p2)的啟動類型則由組成型轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導型

6、，其中鎳是啟動的誘導劑。而啟動子p3只有在整個抗鎳系統(tǒng)存在時才能發(fā)揮作用，且是由鎳誘導表達的。當缺少抗鎳系統(tǒng)中任一成份，啟動子p3不能啟動。 為了分離和鎳誘導有關的蛋白，分別將連有啟動子-報告基因的質(zhì)粒與含有插入突變的質(zhì)粒pNTA，pNTB及pNTC共轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，發(fā)現(xiàn)只有當ncrB基因突變后，啟動子p1及p2的表達類型才能從誘導型轉(zhuǎn)變?yōu)榻M成型。該結(jié)果表明基因ncrB的編碼產(chǎn)物有可能是與鎳誘導有關，它能阻遏啟動子p1