嗜水氣單胞菌的分離鑒定及其Hfq功能的研究.pdf

1、嗜水氣單胞菌是引起水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的一種主要病原菌，對(duì)全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的危害和經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)亦可感染人類，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重威脅，是一種典型的人-魚共患致病菌。深入研究嗜水氣單胞菌的毒力調(diào)控機(jī)制對(duì)于其引發(fā)的病害防治具有重要意義。Hfq是一種廣泛存在于細(xì)菌體內(nèi)的sRNA分子伴侶蛋白，可促進(jìn)不同sRNA分子與其靶標(biāo)mRNA分子間的相互作用，作為轉(zhuǎn)錄后全局調(diào)控因子參與細(xì)菌的多種生理進(jìn)程，并對(duì)多種病原菌的毒力具有重要的調(diào)控作用。本論文

2、從山東煙臺(tái)養(yǎng)殖魚場(chǎng)發(fā)病石斑魚體內(nèi)分離得到一株優(yōu)勢(shì)毒力菌株，通過(guò)生理生化及分子生物學(xué)手段鑒定為嗜水氣單胞菌，以該菌株為研究對(duì)象，克隆得到其hfq基因序列，利用無(wú)標(biāo)記基因缺失手段成功構(gòu)建獲得Δhfq突變株，并進(jìn)一步研究了Hfq對(duì)嗜水氣單胞菌不同生理功能及毒力的調(diào)控作用，為豐富人們對(duì)嗜水氣單胞菌毒力調(diào)控機(jī)制及其科學(xué)防治提供理論依據(jù)。本論文的研究結(jié)果如下：
　　(1)從養(yǎng)殖魚場(chǎng)發(fā)病的石斑魚胰腺組織中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌株，通過(guò)對(duì)其生長(zhǎng)特性、生

3、理生化特性等研究，發(fā)現(xiàn)分離菌株為革蘭氏陰性短桿菌，可形成β溶血圈;能夠發(fā)酵利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、還原硝酸鹽、分解利用麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、蔗糖等，不能分解枸櫞酸鹽、木糖、肌醇等;對(duì)頭孢曲松、磷霉素、等四種極度敏感，對(duì)青霉素、氨芐西林等六種不敏感。進(jìn)一步通過(guò)16S rRNA序列克隆比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析發(fā)現(xiàn)，該菌和其他已知的嗜水氣單胞菌16S rRNA基因序列同源性高達(dá)99％以上，并且在進(jìn)化樹上處于同一個(gè)分支上，結(jié)合生理生化特性確定為嗜

4、水氣單胞菌，人工回歸感染試驗(yàn)表明分離到的嗜水氣單胞菌具有致病性。
　　(2)對(duì)嗜水氣單胞菌hfq基因進(jìn)行了克隆，得到264 bp大小的特異性片段，編碼88個(gè)氨基酸。Hfq蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包含1個(gè)由12個(gè)氨基酸組成α-螺旋區(qū)(H)和32個(gè)氨基酸組成的5個(gè)β-折疊區(qū)(E)，其他區(qū)域均為無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)（-）。Hfq蛋白三維空間結(jié)構(gòu)是一個(gè)中空環(huán)狀的六聚體。成功構(gòu)建了Hfq重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-hfq，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)成功檢測(cè)到一條大小約為

5、12 kDa的特異性蛋白條帶，且其表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。
　　(3)利用自殺質(zhì)粒pDM4，通過(guò)同源重組的方法成功構(gòu)建了嗜水氣單胞菌的無(wú)標(biāo)記hfq基因框內(nèi)缺失突變株Δhfq。通過(guò)對(duì)野生型和Δhfq突變株不同表型測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，Δhfq突變株的生長(zhǎng)相對(duì)于野生型有所下降;在進(jìn)入穩(wěn)定期后，Δhfq突變株的生長(zhǎng)達(dá)到與野生型相當(dāng)?shù)乃?，并在后期略微有所提高。Hfq對(duì)游動(dòng)性具有正調(diào)控作用，對(duì)泳動(dòng)性和溶血活性調(diào)控不明顯;當(dāng)Hfq