2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、本研究以羅丹明B模擬水溶性藥物,用NBD-PC標(biāo)記卵磷脂以示蹤磷脂在皮膚中位置;通過制備并篩選羅丹明B醇質(zhì)體的最佳處方,對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行考察;采用CLSM研究羅丹明B醇質(zhì)體的在體經(jīng)皮滲透過程及促進(jìn)水溶性藥物經(jīng)皮滲透的機(jī)制;并通過TEM研究醇質(zhì)體與大鼠皮膚相互作用后超微結(jié)構(gòu)的改變。
  目的:
  研究醇質(zhì)體促進(jìn)水溶性藥物經(jīng)皮滲透的機(jī)制及對(duì)皮膚超微結(jié)構(gòu)的影響,從而為醇質(zhì)體經(jīng)皮制劑的后續(xù)研發(fā)提供詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐并奠定堅(jiān)實(shí)的理論

2、基礎(chǔ)。
  方法:
  1、采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)表制定0.02%羅丹明B醇質(zhì)體的組方
  以蛋黃卵磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)、無水乙醇的體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間為考察因素,以平均粒徑值作為衡量指標(biāo)確定0.02%羅丹明B醇質(zhì)體最佳處方;
  2、羅丹明B醇質(zhì)體、脂質(zhì)體的制備
  2.1 采用注射超聲法制備羅丹明B醇質(zhì)體:
  用分析天平稱取處方量的蛋黃卵磷脂和羅丹明B。蛋黃卵磷脂置于玻璃瓶中用乙醇溶解,并用磁力攪拌

3、器攪拌均勻,羅丹明B用雙蒸水溶解。然后使玻璃瓶與注射器密封連接,允許加入乙醇而避免乙醇揮發(fā)。羅丹明B溶解后以200μL·min-1的流速加入卵磷脂乙醇溶液中并以700r·min-1的轉(zhuǎn)速用磁力攪拌器攪拌,藥物注入后,再攪拌5min,最后采用探頭式超聲儀以150W的功率冰水浴條件下超聲5min;
  2.2 采用薄膜擴(kuò)散超聲法制備羅丹明B脂質(zhì)體:
  精密稱取處方量的蛋黃卵磷脂(2%,w/v)并置于圓底燒瓶中,加適量的氯仿溶解

4、,圓底燒瓶連接到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上,60℃真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿,直至在燒瓶壁上形成一層均勻的薄膜,真空下過夜以除去殘余的氯仿,然后用羅丹明B(0.02%,w/v)水溶液在室溫下震蕩水化薄膜30min。所得混懸液采用探頭式超聲儀以150W的功率冰水浴條件下超聲5min以均一化粒徑;
  2.3 NBD-PC標(biāo)記0.03%羅丹明B醇質(zhì)體的制備:
  采用前述方法制備,只是在磷脂中加入處方量的NBD-PC(磷脂與NBD-PC的摩爾

5、比為100∶1);
  2.4 未包封的羅丹明B的分離:
  使用Amicon Ultra-4(Millipore Corporation,USA)超濾管(截留分子量為3000Da)分離未包封的羅丹明B。取制備的NBD-PC標(biāo)記的羅丹明B醇質(zhì)體4mL注入超濾管內(nèi),4℃下以12000Xg的離心力離心1h,濾過液丟棄,沉淀管轉(zhuǎn)入一個(gè)新的收集管,4℃下以1000Xg的離心力離心5min以獲得無游離羅丹明B的NBD-PC標(biāo)記的羅丹明

6、B醇質(zhì)體。為了防止熒光淬滅,獲得的制劑立即用于皮膚滲透實(shí)驗(yàn);
  3、采用馬爾文粒徑儀檢測(cè)羅丹明B醇質(zhì)體、脂質(zhì)體的粒徑及電荷
  采用馬爾文粒徑儀測(cè)定醇質(zhì)體和脂質(zhì)體的平均粒徑和電荷,激光束波長633nm,入射與散射光夾角90°,溫度25℃。分別以制備時(shí)相同濃度的乙醇溶液和雙蒸水稀釋醇質(zhì)體和脂質(zhì)體至一定濃度后測(cè)定,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次;
  4、采用透射電鏡觀察羅丹明B醇質(zhì)體的形態(tài)
  羅丹明B醇質(zhì)體用制備時(shí)相同濃

7、度的乙醇溶液稀釋后,水浴超聲30min。取適量制劑滴于銅網(wǎng)上,并用2%磷鎢酸負(fù)染,用濾紙吸去多余的染液,用透射電鏡在80KV的加速電壓下觀察粒子形態(tài);
  5、通過溫度和時(shí)間的變化來考察0.02%羅丹明B醇質(zhì)體的穩(wěn)定性
  分別將0.02%羅丹明B醇質(zhì)體存放于4±1℃和25±1℃條件下90d后,采用馬爾文粒徑儀測(cè)定0.02%羅丹明B醇質(zhì)體的粒徑來評(píng)價(jià)羅丹明B醇質(zhì)體的穩(wěn)定性;
  6、羅丹明B醇質(zhì)體的在體經(jīng)皮滲透

8、  采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠隨機(jī)分為4組(n=6)。在體經(jīng)皮實(shí)驗(yàn)前使用水合氯醛腹腔麻醉大鼠,然后用電動(dòng)剃毛刀剃去腹部毛發(fā),避免傷及皮膚并用生理鹽水清潔皮膚。待腹部皮膚干燥后,用氰基丙烯酸鹽粘合劑把面積為0.64cm2的玻璃圓柱粘附在豚鼠腹部皮膚作為給藥池,在給藥過程中玻璃圓柱保持水平。把200μ L的各種制劑加入玻璃圓柱內(nèi),使用透明薄膜覆蓋以防止蒸發(fā),整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格避光。每組大鼠中的三只分別于設(shè)定的1,4,8h時(shí)間點(diǎn)采用頸椎脫臼法

9、處死大鼠,用紗布清除多余的制劑,再用生理鹽水清洗給藥部位皮膚至少3次。接著使用手術(shù)刀及剪刀切下給藥區(qū)域皮膚并剔除皮下脂肪,所取皮膚組織立即用于制作冰凍切片。而每組中的另外三只大鼠在給藥8h后,用紗布清除多余的制劑,生理鹽水清洗給藥皮膚至少3次。并在清除藥物后的1,4,8h時(shí)間點(diǎn)采用頸椎脫臼法處理大鼠,并以相同的方法處理給藥部位皮膚;
  7、醇質(zhì)體促進(jìn)水溶性藥物的經(jīng)皮滲透機(jī)制研究
  采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠隨機(jī)分為三組(

10、n=3)。在體經(jīng)皮實(shí)驗(yàn)前使用水合氯醛腹腔麻醉大鼠,然后用電動(dòng)剃毛刀剃去腹部毛發(fā),避免傷及皮膚并用生理鹽水清潔皮膚。待腹部皮膚干燥后,用氰基丙烯酸鹽粘合劑把面積為0.64cm2的玻璃圓柱粘附在豚鼠腹部皮膚作為給藥池,在給藥過程中圓柱保持水平。把200μL的NBD-PC標(biāo)記羅丹明B醇質(zhì)體加入玻璃圓柱內(nèi),使用透明薄膜覆蓋以防止蒸發(fā),整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格避光。分別于設(shè)定的1,4,8h時(shí)間點(diǎn)采用頸椎脫臼法處死大鼠,用紗布清除多余的制劑,再用生理鹽水

11、清洗給藥部位皮膚至少3次。接著使用手術(shù)刀取下給藥區(qū)域皮膚并剔除皮下脂肪,所取皮膚組織立即用于制作冰凍切片;
  8、皮膚組織冰凍切片的制備
  采用冰凍切片結(jié)合CLSM分析技術(shù)來觀察各制劑透皮后各熒光素在皮膚內(nèi)各層的分布。把各時(shí)間點(diǎn)取下的皮膚標(biāo)本放在冰凍切片機(jī)的樣品托上,加適量OCT于-20℃溫度下對(duì)樣品進(jìn)行冷凍。切片厚度為8μm,用防脫載玻片貼片,無水甘油封片。及時(shí)用CLSM觀察各熒光素在皮膚內(nèi)的分布;
  9、皮膚

12、組織超薄切片制備
  使用TEM觀察給藥部位皮膚的超微結(jié)構(gòu)的改變,并以正常皮膚作對(duì)照。皮膚標(biāo)本切成2×4mm2大小,2.5%的戊二醛4℃下固定過夜,1%的四氧化鋨固定2h,然后用(35%,50%,70%,95%,和100%)的梯度酒精脫水,最后樹脂包埋并在70℃下孵育8h。使用超薄切片機(jī)切片,切片置于銅網(wǎng)上,然后使用醋酸鈾和檸檬酸鉛負(fù)染,采用TEM觀察拍照;
  10、激光共聚焦顯微鏡掃瞄皮膚組織冰凍切片
  各時(shí)間點(diǎn)

13、組織切片內(nèi)熒光素的分布采用CLSM進(jìn)行觀察。CLSM的各項(xiàng)參數(shù)在掃描中保持一致,羅丹明B用波長為568nm的氪激光激發(fā),發(fā)射熒光為紅色,NBD-PC用波長為488nm的氬激光激光,發(fā)射的熒光為綠色,物鏡為30倍。各切片的平均熒光強(qiáng)度及熒光面積使用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析,然后對(duì)平均熒光強(qiáng)度及平均熒光面積作時(shí)間圖。同時(shí)對(duì)各熒光圖像進(jìn)行皮膚自身熒光校正;
  11、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
  采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)

14、據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩樣本均數(shù)間的比較用T檢驗(yàn),多組樣本均數(shù)之間的比較:當(dāng)滿足方差齊性時(shí),使用單向方差分析和樣本均數(shù)間的多重比較(LSD法);當(dāng)不滿足方差齊性時(shí)使用近似F檢驗(yàn)(Welch檢驗(yàn)方法)及校正的多重比較方法(Dunnett's T3)。并使用Origin7.5繪制統(tǒng)計(jì)圖。當(dāng)P<0.05時(shí)視為具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果中數(shù)據(jù)以(X)±S表示;
  結(jié)果:
  1、根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果,確定0.02%羅丹明B醇質(zhì)體的最佳

15、處方為:35%(v/v)無水乙醇,2%(w/v)蛋黃卵磷脂,0.02%(w/v)羅丹明B;影響羅丹明B醇質(zhì)體粒徑的主次因素順序?yàn)?無水乙醇濃度>蛋黃卵磷脂濃度>超聲時(shí)間;根據(jù)最佳處方制備的羅丹明B醇質(zhì)體的粒徑為:113.5±2.3nm(n=3);
  2、透射電鏡(TEM)觀察0.02%羅丹明B醇質(zhì)體的形態(tài)為大小較為均一的圓形小球;
  3、馬爾文動(dòng)態(tài)激光粒度儀(Malvern)測(cè)得0.02%羅丹明B醇質(zhì)體的大小為:113.

16、5±2.3nm(n=3),多分散指數(shù)(PDI)為0.132±0.035(n=3),電荷為-19.5±2.3mV(n=3);
  4、將0.02%羅丹明B醇質(zhì)體保存于不同溫度并于90d之后測(cè)定其粒徑,結(jié)果顯示:醇質(zhì)體在4±1℃條件下的粒徑發(fā)生了顯著性變化(P=0.000),但在25±1℃條件下,羅丹明B醇質(zhì)體的粒徑變化不顯著(P=0.126);
  5、平均熒光面積和強(qiáng)度代表各種制劑進(jìn)入皮膚內(nèi)的深度和量。制劑經(jīng)皮滲透1h后,羅

17、丹明B醇質(zhì)體組可見在角質(zhì)層和淺層毛囊有較明亮的紅色熒光。羅丹明B醇質(zhì)體組的平均熒光面積和平均熒光強(qiáng)度與羅丹明B脂質(zhì)體、醇水溶液、水溶液相比具有顯著差異性(P=0.000),但羅丹明B脂質(zhì)體與羅丹明B醇水溶液平均熒光面積(P=0.908)和平均熒光強(qiáng)度(P=0.863)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4h后羅丹明B醇質(zhì)體組紅色熒光分布在深層毛囊及真皮深層。羅丹明B醇質(zhì)體與其余制劑的熒光面積和平均熒光強(qiáng)度比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000),羅丹明B脂質(zhì)體

18、與醇水溶液的平均熒光面積(P=0.002)和平均熒光密度(P=0.001)亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。8h時(shí)羅丹明B醇質(zhì)體在真皮深層的紅色熒光亮度更強(qiáng)。醇質(zhì)體與其余制劑的熒光面積和平均熒光強(qiáng)度比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)。各種制劑經(jīng)皮給藥8h后去除皮膚表面多余的制劑后皮膚內(nèi)熒光逐漸減弱,去除藥物1h后羅丹明B醇質(zhì)體組可見紅色熒光分布在角質(zhì)層、真皮淺層、毛囊內(nèi),真皮深層無紅色熒光。醇質(zhì)體與脂質(zhì)體(P=0.000)、醇水溶液(P=0.001)、

19、水溶液(P=0.000)的平均熒光面積相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,平均熒光強(qiáng)度亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)。4h后羅丹明B醇質(zhì)體在淺層毛囊和角質(zhì)層可見明亮紅色熒光,醇質(zhì)體與與脂質(zhì)體(P=0.000)、醇水溶液(P=0.002)、水溶液(P=0.000)的平均熒光面積相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,平均熒光強(qiáng)度亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)。8h時(shí)羅丹明B醇質(zhì)體在角質(zhì)層可見少量紅色熒光分布,醇質(zhì)體與其余制劑的平均熒光面積相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0

20、.000),與脂質(zhì)體(P=0.000)、醇水溶液(P=0.002)、水溶液(P=0.000)的平均熒光強(qiáng)度相比亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;
  6、使用CLSM觀察羅丹明B和NBD-PC在皮膚內(nèi)的分布情況。制劑經(jīng)皮1h時(shí)皮膚淺層毛囊內(nèi)可見明亮綠色熒光,且毛干內(nèi)充滿綠色熒光,而皮膚角質(zhì)層的綠色熒光很弱;紅色熒光在角質(zhì)層成較暗的帶狀分布,皮膚淺層毛囊亦有較弱紅色熒光分布,但毛干中央未見紅色熒光。4h時(shí)在皮膚深層的毛囊可見綠色熒光分布,角質(zhì)層的綠色

21、熒光較強(qiáng)且呈帶狀分布,此時(shí)紅色熒光在角質(zhì)層呈明亮的帶狀分布,皮膚淺層毛囊的紅色熒光逐漸增強(qiáng),皮膚深層的毛囊也開始出現(xiàn)紅色熒光。8h時(shí)綠色熒光依然分布在角質(zhì)層和毛囊內(nèi),但紅色熒光除了分布在角質(zhì)層和毛囊外,在活性表皮層亦可見分布,而在真皮層分布不明顯;
  7、采用TEM研究NBD-PC標(biāo)記羅丹明B醇質(zhì)體與皮膚相互作用后皮膚超微結(jié)構(gòu)的改變。由正常對(duì)照皮膚的TEM圖像可知,皮膚角質(zhì)層結(jié)構(gòu)緊密,角質(zhì)細(xì)胞扁平,活性表皮層可見橋粒分布,基底膜

22、帶結(jié)構(gòu)完整,可見清晰的半橋粒。NBD-PC標(biāo)記羅丹明B醇質(zhì)體在大鼠腹部皮膚經(jīng)皮應(yīng)用4h的電鏡圖顯示:角質(zhì)細(xì)胞腫脹變大,角質(zhì)橋粒斷裂導(dǎo)致角質(zhì)層整體結(jié)構(gòu)疏松,角質(zhì)細(xì)胞間間隙明顯增寬,角質(zhì)層不同深度均可見完整的脂質(zhì)囊泡,部分囊泡崩解破裂成脂質(zhì)碎片分布在角質(zhì)細(xì)胞間,角質(zhì)層深層的疏松度較淺層明下降,顆粒層結(jié)構(gòu)未見改變,細(xì)胞間橋粒完整,未見脂質(zhì)囊泡和脂質(zhì)碎片分布,真皮乳頭層基底膜結(jié)構(gòu)完整,未見半橋粒破壞;
  結(jié)論:
  1、0.02%

23、的羅丹明B醇質(zhì)體為大小較為均一的圓形小球,粒徑小,分散指數(shù)小,帶負(fù)電荷,在25±1℃下保存穩(wěn)定性好;
  2、在體經(jīng)皮滲透試驗(yàn)結(jié)果表明:醇質(zhì)體的在體經(jīng)皮滲透時(shí)滯短,其在皮膚內(nèi)的滲透深度及滲透量均顯著高于脂質(zhì)體、醇水溶液和水溶液。醇質(zhì)體在皮膚內(nèi)的儲(chǔ)留時(shí)間長于脂質(zhì)體、醇水溶液、水溶液;
  3、醇質(zhì)體經(jīng)皮給藥時(shí)一部分囊泡迅速分布至毛囊區(qū),且由毛囊淺層向深層及毛囊周圍滲透,其余的醇質(zhì)體則通過角質(zhì)細(xì)胞間進(jìn)入角質(zhì)層;
  4、醇

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