新型經(jīng)皮局麻藥物制劑一利多卡因醇質(zhì)體的研究.pdf

1、研究背景:目前臨床急需一種起效快、效果好、副作用小且能維持手術(shù)時(shí)間的新型皮膚局麻藥物制劑,用以滿足皮膚穿刺性檢查、皮膚外科手術(shù)以及激光美容等各種醫(yī)療手段所引起的皮膚淺表創(chuàng)傷性疼痛的鎮(zhèn)痛需要。目前已有的經(jīng)皮局麻藥物制劑如EMLA乳膏、或者其它局麻藥物的相關(guān)制劑,如酊劑、凝膠和霜劑等由于副作用明顯或經(jīng)皮滲透效果不理想等原因而達(dá)不到安全、有效的局麻目的。
　　 影響藥物經(jīng)皮速率的主要是皮膚角質(zhì)層屏障,而目前增加藥物皮膚滲透性的主要方法

2、包括采用物理或化學(xué)的方法,但是以上方法均存在一定的局限性和不足之處,如加入化學(xué)促滲劑易干擾皮膚細(xì)胞的結(jié)構(gòu),而某些新型物理經(jīng)皮裝置或方式,如微針等則存在高成本及難以避免的皮膚傷害性。因此,新經(jīng)皮劑型載體的研發(fā)在經(jīng)皮給藥系統(tǒng)(Transdermal drug delivery systems,TDDS)研究中依舊占據(jù)著極其重要的地位,它將對局麻藥物迅速進(jìn)入皮膚起決定性的作用。醇質(zhì)體是一種新型的囊泡結(jié)構(gòu)并含有一定比例醇的脂質(zhì)體,由磷脂、膽固醇

3、、醇及水組成。醇質(zhì)體具有熱力學(xué)穩(wěn)定、粒徑小、包封率高、透皮性能強(qiáng)、皮膚耐受性能好等特點(diǎn),因此,用它作為局麻藥物的載體,在使用安全的前提下,以便有效增強(qiáng)藥物的經(jīng)皮滲透性,從而起到安全、迅速起效的作用效果。
　　 本研究擬選擇具有起效快,藥效好,彌散性廣,安全性好,無明顯血管擴(kuò)張等特點(diǎn)的酰胺類局麻藥-利多卡因制備利多卡因醇質(zhì)體經(jīng)皮局麻制劑,并對其形態(tài)、粒徑、包封率、穩(wěn)定性等理化性質(zhì),以及經(jīng)皮滲透性、安全性和藥效學(xué)等方面展開全面的分析

4、和評價(jià)。
　　 目的:確定制備利多卡因醇質(zhì)體的組方:分析及評價(jià)利多卡因醇質(zhì)體微粒的形態(tài)、粒徑大小、包封率、穩(wěn)定性、經(jīng)皮滲透性及其影響因素、使用安全性和藥效學(xué)。研究成果將為臨床提供一種安全性好、局麻迅速且能維持一定手術(shù)時(shí)間的新型經(jīng)皮局麻藥物制劑。
　　 方法
　　 1.采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)表制定5％利多卡因醇質(zhì)體的組方以無水乙醇、蛋黃卵磷脂、膽固醇的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為考察因素,以包封率為衡量指標(biāo)確定5％利多卡因醇

5、質(zhì)體最佳處方；
　　 2.5％利多卡因醇質(zhì)體、脂質(zhì)體的制備
　　 ①采用注射超聲過濾法制備5％利多卡因醇質(zhì)體:稱取處方量的無水乙醇、蛋黃卵磷脂、膽固醇、利多卡因、超純水,依次加入10mL的離心管中,置于渦旋混勻器上混勻至完全溶解后于超聲粉碎儀下超聲(冰水浴條件下),超聲處理功率為105w,時(shí)間為2min,超聲處理后用0.22岬針頭式過濾器過濾即得5％利多卡因醇質(zhì)體；
　　 ②采用薄膜擴(kuò)散法制備5％利多卡因脂質(zhì)體:

6、稱取處方量的蛋黃卵磷脂、膽固醇、利多卡因,加入裝有6mL無水乙醇的梨形瓶中,然后將梨形瓶接到真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上,直至梨形瓶中有一層脂質(zhì)薄膜層形成,取下梨形瓶,加入超純水充分水和,再按照醇質(zhì)體制備方法超聲處理后即得5％利多卡因脂質(zhì)體；
　　 3.聯(lián)用透析袋平衡透析法及高效液相色譜法測定各組方醇質(zhì)體的載藥率及包封率
　　 ①載藥率:將50μL待測樣品于10mL容量瓶中甲醇定容,混勻,超聲處理10min,行高效液相色譜檢測,以分

7、析樣品載藥率；
　　 ②包封率:將透析袋剪成約10cm長小段,于沸水中煮沸10min后將透析袋清洗干凈,將透析袋一端封閉并檢查透析袋是否滲漏,加入2mL待測樣品后封閉另一端,將透析體系置于無水乙醇含量為2％的250mL,醇水溶液中,置于磁力攪拌器上持續(xù)攪拌(60rpm,25℃),平衡9h后取透析袋外液行HPLC測定游離利多卡因的含量。同時(shí)行空白醇質(zhì)體對照,以排除輔料的干擾；
　　 4.采用透射電鏡觀察最佳處方醇質(zhì)體的形態(tài)

8、先吸取1滴5％利多卡因醇質(zhì)體滴于銅網(wǎng)上,2min后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余的液體；再滴加1滴磷鎢酸(3％,pH7.0)于銅網(wǎng),2min后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余染液；然后滴加1滴超純水于銅網(wǎng),用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸取多余水,自然晾干后,120KV加速電壓下利用透射電鏡下觀察5％利多卡因醇質(zhì)體的形態(tài):
　　 5.采用馬爾文粒徑儀測量5％利多卡因醇質(zhì)體的粒徑將2mL的5％利多卡因醇質(zhì)體倒入測試杯中,無需進(jìn)一步濃縮或稀釋處理,以90°角光

9、電倍增管測定其粒徑；
　　 6.采用Franz擴(kuò)散池比較測定5％利多卡因醇質(zhì)體、脂質(zhì)體及醇水溶液的體外透皮性能,比較分析醇質(zhì)體組方構(gòu)成對醇質(zhì)體經(jīng)皮滲透的影響取雄性SD大鼠(250—300g),苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉,電動剃刀剃去腹部鼠毛,取下已去毛的鼠皮并小心分離皮下組織與脂肪,用生理鹽水反復(fù)沖洗,濾紙吸干即刻使用,大鼠腹部皮膚的角質(zhì)層面朝向供給池。擴(kuò)散池有效滲透面積為2.92cm2,接收池容積為7mL,接收液為乙醇濃度為5％的

10、醇水溶液。電磁攪拌器轉(zhuǎn)速為300rpm,溫度為:37±1℃,并分別于0.5,1,2,3,6,9,11h取出接受液0.4mL后高速離心10min后取上清液行高效液相色譜檢測,樣品取出后以及加入等體積的新鮮接收液。加入接收池的5％利多卡因醇質(zhì)體、脂質(zhì)體、醇水溶液以及空白醇質(zhì)體、脂質(zhì)體、醇水溶液均為1.5mL;
　　 7.通過溫度和時(shí)間的變化來考察5％利多卡因醇質(zhì)體的穩(wěn)定性分別將5％利多卡因醇質(zhì)體存放于4±1℃,25±1℃及37±1℃

11、條件下60天后,采用高效液相色譜(HPLC)分析測定5％利多卡因醇質(zhì)體的包封率來評價(jià)利多卡因醇質(zhì)體微粒的穩(wěn)定性；
　　 8.采用豚鼠背部皮膚局部浸潤法比較測定5％利多卡因醇質(zhì)體、脂質(zhì)體及醇水溶液的局麻藥效將豚鼠背部毛發(fā)剃凈,將5％利多卡因醇質(zhì)體、脂質(zhì)體及和醇水溶液涂布在無毛皮膚上,在預(yù)定時(shí)間(給藥后的10,15,20,25,30,40,50,60,80,100,120min)用針刺法刺激給藥部位周邊6mm帶狀區(qū)域的皮膚,觀察皮膚

12、的負(fù)反應(yīng)數(shù)；同法,將上述3種藥物作用于豚鼠背部皮膚1小時(shí)后將藥物拭去,并于去除藥物后的10,20,40,60,80,100,120min時(shí)分別采用針刺法測定給藥豚鼠的負(fù)反應(yīng)數(shù)；
　　 9.5％利多卡因醇質(zhì)體作用于豚鼠背部皮膚后,通過肉眼評測法及組織病理學(xué)檢測法對制劑的使用安全性進(jìn)行有效評估白色雄性豚鼠(250—300g)的背部毛發(fā)用電動剃刀剃凈后,將背部的皮膚分成完整皮膚和破損皮膚兩組,利用磨砂紙垂直、水平磨擦豚鼠背部皮膚以形成

13、破損皮膚。將5％利多卡因醇質(zhì)體作用于豚鼠背部完整皮膚和破損皮膚,觀察作用部位紅斑、水腫表現(xiàn)并按評測標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分,并通過組織病理學(xué)觀察和評測利多卡因醇質(zhì)體的安全性。紅斑計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為:無紅斑計(jì)0分,輕度紅斑計(jì)1分,明顯紅斑計(jì)2分,中度至重度紅斑計(jì)3分,深度紅斑并紫痂計(jì)4分；水腫計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為:無水腫計(jì)0分,輕度水腫計(jì)1分,輕度水腫(可見水腫輪廓)計(jì)2分,中度水腫計(jì)3分,重度水腫計(jì)4分；組織病理學(xué)考察指標(biāo)包括:角質(zhì)層結(jié)構(gòu)的變化,真皮層有無明顯的中性

14、粒細(xì)胞浸潤、血管擴(kuò)張充血、血管周圍炎性細(xì)胞浸潤、血管炎、真皮水腫或出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增生和纖維化等真皮組織炎癥性病理改變；
　　 10.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 ①采用SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；
　　 ②多組樣本均數(shù)之間的比較:當(dāng)滿足方差齊性時(shí),使用單向方差分析和樣本均數(shù)間的多重比較(LSD法)；當(dāng)不滿足方差齊性時(shí)使用近似F檢驗(yàn)(Welch檢驗(yàn)方法)及校正的多重比較方法(Dunnett's,T3)；
　　

15、 ③正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ V3.1進(jìn)行分析；
　　 ④對重復(fù)測量數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測量方差分析；
　　 ⑤使用Graphpad Prism5.0繪制曲線；
　　 ⑥以P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)果中數(shù)據(jù)以X±SD表示。
　　 結(jié)果
　　 1.根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果,確定5％利多卡因醇質(zhì)體的最佳處方為:35％無水乙醇,5％蛋黃卵磷脂,0.2％膽固醇,5％利多卡因,49.8％超純水(百分?jǐn)?shù)為質(zhì)量

16、百分?jǐn)?shù)比)；影響利多卡因醇質(zhì)體包封率的主次因素順序?yàn)?蛋黃卵磷脂濃度>無水乙醇濃度>膽固醇濃度；根據(jù)最佳處方制備的利多卡因醇質(zhì)體的載藥率為:(95.0±0.06)％(n=3),包封率為:(51.44±3.75)％(n=7)。
　　 2.利用薄膜擴(kuò)散法制備的5％利多卡因脂質(zhì)體的載藥率為:(98.85±0.24)％(n=4)；包封率為:(46.20±1.50)％(n=7)。
　　 3.HPLC色譜條件為:色譜柱:C8柱(HR

17、C-C8,SHIMADZU,250×4.6mm,5μm)；流動相:甲醇:乙酸銨溶液(Ph=6.71)=70:30;檢測波長:270nm;流速:0.8mL·min-1；柱溫:30℃；進(jìn)樣量:10μL。
　　 4.透射電鏡(TEM)觀察5％利多卡因醇質(zhì)體形態(tài)為大小較均一的圓形球體。
　　 5.馬爾文粒徑儀(Malvem)測得5％利多卡因醇質(zhì)體的粒徑大小為:31.33±2.63nm(n=3),多分散性指數(shù)為0.42±0.21(

18、n=3)。
　　 6.5％利多卡因醇質(zhì)體、脂質(zhì)體、醇水溶液的體外累計(jì)透皮吸收量通過重復(fù)測量方差分析發(fā)現(xiàn):
　　 ①重復(fù)效應(yīng)和交互效應(yīng)的方差分析結(jié)果顯示:三組制劑之間存在顯著性差異(F=110.970,P<0.001)；透皮時(shí)間之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=369.059,P<0.001):制劑和透皮時(shí)間之間存在顯著的交互效應(yīng)(F=179.226,P<0.001)
　　 ②醇質(zhì)體、脂質(zhì)體和醇水溶液三組制劑的經(jīng)皮累積透皮吸

19、收值進(jìn)行比較,不滿足方差齊性(F=71.654,P<0.001),使用近似Welch方法進(jìn)行分析,三組制劑間存在顯著差異(F=19.001,P<0.001),各制劑間多重比較使用Dunnett's T3進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:醇質(zhì)體與脂質(zhì)體之間存在顯著性差異(P=0.001),醇質(zhì)體與醇水溶液之間存在顯著性差異(P<0.001),脂質(zhì)體和醇水溶液間存在顯著性差異(P=0.004)；
　　 ③醇質(zhì)體0.5-11h的累積透皮量Q對時(shí)間t

20、回歸得線性方程:Q=421.664t-187.120(R2=0.912,F=340.198,P=0.000),累計(jì)透皮量與時(shí)間t線性關(guān)系良好,皮膚滲透速率為421.7±22.86μg.cm-2·h-1；
　　 ④脂質(zhì)體0.5-11h的累積透皮量Q對時(shí)間t回歸得線性方程:Q=135.435t-73.837(R2=0.918,F=368.175,P<0.001),皮膚滲透速率為:135.435±7.058μg·cm-2·h-1；

21、r>　　 ⑤醇水溶液脂質(zhì)體0.5—11h的累積透皮量Q對時(shí)間t回歸得線性方程:Q=46.832t-0.750(R2=0.735,F=91.753,P<0.001),皮膚滲透速率為:46.832±4.889μg·cm-2·h-1；
　　 ⑥醇質(zhì)體的皮膚滲透速率分別是脂質(zhì)體和醇水溶液的3.113和9.004倍。
　　 7.5％利多卡因醇質(zhì)體、脂質(zhì)體及醇水溶液作用于豚鼠完整皮膚后,豚鼠皮膚對刺激產(chǎn)生負(fù)反應(yīng)的重復(fù)測量分析結(jié)果顯

22、示:
　　 ①重復(fù)效應(yīng)和交互效應(yīng)的方差分析結(jié)果顯示:三組制劑之間存在顯著性差異(F=14.918,P<0.001)；作用時(shí)間之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=863.566,P<0.001):制劑和作用時(shí)間之間無顯著的交互效應(yīng)(F=2.401,P=0.101):
　　 ②醇質(zhì)體、脂質(zhì)體和醇水溶液三組制劑作用于豚鼠皮膚的負(fù)反應(yīng)進(jìn)行比較,滿足方差齊性(F=1.638,P=0.199),三組制劑間存在顯著差異(F=7.696,P=0.0

23、01),各制劑間多重比較使用LSD法進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:醇質(zhì)體與脂質(zhì)體之間存在顯著性差異(P=0.004),醇質(zhì)體與醇水溶液之間存在顯著性差異(P<0.001),脂質(zhì)體和醇水溶液間無顯著性差異(P-0.443)。
　　 對5％利多卡因醇質(zhì)體、脂質(zhì)體及醇水溶液這三種藥物豚鼠完整皮膚組涂藥1h后去除藥物,豚鼠對刺激的負(fù)反應(yīng)數(shù)(次/只)進(jìn)行重復(fù)測量分析顯示:
　　 ①重復(fù)效應(yīng)和交互效應(yīng)的方差分析結(jié)果顯示:三組制劑之間存在顯著性

24、差異(F=226.925,P<0.001)；作用時(shí)間之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=106.462,P<0.001)；制劑和作用時(shí)間之間存在顯著的交互效應(yīng)(F=3.335,P<0.001)；
　　 ②醇質(zhì)體、脂質(zhì)體和醇水溶液三組制劑作用于豚鼠完整皮膚1h后去除藥物,豚鼠皮膚對刺激產(chǎn)生負(fù)反應(yīng)進(jìn)行比較,滿足方差齊性(F=1.6382.323,P=0.102),三組制劑間存在顯著差異(F=128.489,P<0.001),各制劑間多重比較使用

25、LSD法進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:醇質(zhì)體與脂質(zhì)體之間存在顯著性差異(P<0.001),醇質(zhì)體與醇水溶液之間存在顯著性差異(P<0.001),脂質(zhì)體和醇水溶液間存在顯著性差異(P<0.001)。
　　 8.5％利多卡因醇質(zhì)體的時(shí)間和溫度穩(wěn)定性檢測通過測定于不同溫度下存放60天的5％利多卡因醇質(zhì)體的包封率來評價(jià):
　　 ①對利多卡因醇質(zhì)體的穩(wěn)定性進(jìn)行協(xié)方差分析,在排除了60天前基礎(chǔ)包封率對于醇質(zhì)體存放60天后的包封率的影響后,不同

26、溫度問包封率是有顯著性差異的(F=58.190,P<0.001),而60天前基礎(chǔ)包封率對于存放60天后的包封率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.065,P=0.802)；
　　 ②利多卡因醇質(zhì)體的不同時(shí)間的包封率的比較,不滿足方差齊性檢驗(yàn)(F=33.496,P<0.001),使用Welch方法進(jìn)行分析,不同時(shí)間和溫度下的包封率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=205.640,P<0.001)；
　　 ③不同時(shí)間組的包封率的比較使用Dunnett'

27、s T3進(jìn)行分析:醇質(zhì)體在4±1℃存放60天包封率與60天前5％利多卡因包封率比較有顯著性差異(P<0.001),在37±1℃存放60天包封率與60天前5％利多卡因包封率比較有顯著性差異(P=0.048),但是在25±1℃條件下存放60天后的5％利多卡因醇質(zhì)體包封率較60天前5％利多卡因包封率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000)。結(jié)果顯示:存放60天后,在4±1℃條件下,5％利多卡因醇質(zhì)體的藥物泄漏率最大,37±1℃次之,而在25±1℃條件下

28、,泄漏率最小。
　　 9.豚鼠背部皮膚給藥后的紅斑和水腫情況觀察顯示:無明顯紅斑和水腫情況出現(xiàn)；組織學(xué)檢查結(jié)果顯示:完整皮膚和破損皮膚經(jīng)利多卡因醇質(zhì)體處理lh時(shí),皮膚表皮結(jié)構(gòu)基本完整,角質(zhì)層變薄,破損皮膚的角質(zhì)層受到一定程度的損害。完整皮膚和破損皮膚經(jīng)利多卡因醇質(zhì)體處理24h后,表皮結(jié)構(gòu)仍完整,破損皮膚角質(zhì)層得到一定程度的恢復(fù)。完整皮膚和破損皮膚經(jīng)利多卡因醇質(zhì)體處理48h后,表皮結(jié)構(gòu)完整,皮膚角質(zhì)層恢復(fù)程度較前更加明顯。完整皮膚

29、和破損皮膚在經(jīng)利多卡因醇質(zhì)體處理72h后角質(zhì)層較正常皮膚無明顯變化。完整皮膚和破損皮膚在1h、24h、48h及72h時(shí),皮膚真皮均無明顯中性粒細(xì)胞浸潤、血管擴(kuò)張充血、血管周圍炎性細(xì)胞浸潤、血管炎、真皮水腫或出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增生和纖維化等真皮組織炎性病理改變。
　　 結(jié)論
　　 1.5％利多卡因醇質(zhì)體為大小均一的圓形微粒,分散指數(shù)小,包封率較高、于25℃室溫保存下為宜；
　　 2.體外經(jīng)皮滲透結(jié)果顯示:醇質(zhì)體的經(jīng)皮滲